水稻条叶枯病毒基因产物在水稻和昆虫体内的Western印迹分析

将AStV基因组组分3编码的NS3和NC蛋白基因以及组分4编码的NCP和NSvc4蛋白基因分别克隆于大肠杆菌表达载体pGEX3X在IPTG诱导下，表达出4种融合蛋白。这些表达产物用于免疫动物产生多克隆抗血清。以制备的多克隆抗血清为探针，Western印迹分析了宿主植物和介体昆虫体内NS3、NC、NCP和NSvc4种基因表达的产物。NC蛋白的抗体可在病株和病毒粒子制备物中以及NCP抗血清仅在病株中检测到相应大小的产物，其余的均与预期值相停。

中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(MIH1)基因的cDNA片段克隆和Northern印迹分析

根据其他蟹类蜕皮抑制激素的氨基酸序列设计了简并引物,运用RT PCR和RACE技术,从中华绒螯蟹(E riocheirjaponicasinensis)成体的蜕皮间期眼柄中,克隆了1条长1145bp的cDNA。该cDNA编码60个氨基酸,包括942bp的3′端非翻译区。同源性分析结果表明,该cDNA编码的氨基酸序列和其他蟹类蜕皮抑制激素有较高的一致性,最高的一致性为64%,将获得的序列命名为中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因(GenBank检索号:AY309062)。用Northern印迹分析的方法对处于各个发育阶段的胚胎及状幼体期该基因的表达进行了研究,结果表明,处于胚胎发育早期的卵裂期几乎没有检测到杂交信号,而胚胎发育的其他时期和状幼体期都检测到蜕皮抑制激素1基因的mRNA。中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因部分cDNA序列的获得为进一步获得该基因的全长cDNA、研究其功能及阐明中华螯蟹蜕皮的分子机制奠定了基础。

红藻氨酸诱导大鼠癫痫发作脑组织HSP70表达的免疫组化及免疫印迹分析

目的探讨热休克蛋白（ＨＳＰ）７０在癫痫发作后的表达及作用。方法用免疫组化及免疫印迹分析法观察红藻氨酸诱导大鼠癫痫发作后ＨＳＰ７０的表达及其动态演变过程。结果正常海马结构含有一定量的组成性ＨＳＰ７０（ＨＳＣ７０），发作后３ｈ即有ＨＳＰ７０表达，２４ｈ达高峰（Ｐ＜０．０１），４８ｈ开始下降，持续至少７ｄ。在２４ｈ，ＨＳＰ７０免疫反应（ＨＳＰ７０－ＩＲ）阳性细胞主要分布在边缘结构。结论ＨＳＰ７０表达是癫痫发作所致细胞损伤的标志，并可能预示细胞死亡或存活。

人血浆因子V蛋白免疫印迹分析及其临床应用

目的 建立人血浆因子Ｖ（ＦＶ）蛋白免疫印迹分析，对遗传性ＦＶ缺乏症家系成员血浆ＦＶ含量进行分析。方法 以３３％饱和硫酸铰从多克隆兔抗人ＦＶ抗血清中纯化ＩｇＧ，待测血浆行４％～１２％梯度的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，继之电转印至硝酸纤维膜上。结果 在３３０ ｋＤ附近，正常人混合血浆呈现一明显的条带，患者母亲对应条带的显色强度明显弱于正常对照，而患者则完全缺如，且未能检出其他较小的ＦＶ片段产物。结论 我们建立的人血浆ＦＶ蛋白免疫印迹分析法对于遗传性ＦＶ缺乏症的辅助诊断及分型具有重要作用。该家系属于Ｉ型遗传性ＦＶ缺乏。

老年期痴呆患者血清Tau蛋白免疫印迹分析

目的 探讨血清Tau蛋白水平对老年期痴呆患者临床诊断的意义.方法 应用单克隆抗Tau蛋白抗体(Anti-Tau l)和免疫狭缝印迹(ISB)技术对112例老年期痴呆患者[Alzheimer病(AD)75例、多发性梗塞性痴呆(MID)37例]和24名年龄配对的老年健康人的血清测定Tau蛋白水平,用分子分析仪并联计算机(IBM)扫描进行分析,血清Tau蛋白的相对浓度以校准强度(CI)表示.结果 本研究显示老年期痴呆患者组的血清Tau蛋白含量(CI值:总计=0.114±0.03,AD=0.110 ±0.03,MID=0.123 ±0.04)与对照组(CI值为0.116±0.04)的差异无显著性(P值均>0.05),也不受有或无apo E_4等位基因(∈_4)的影响.结论 在临床上诊断老年期痴呆时,有必要采用相同技术对脑脊液(CSF)中的和血清中的Tau蛋白进行同步分析比较.

不育相关AsAb的免疫印迹分析

用精子膜抗原Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析法，对７８例生育、１９８例不孕、２２例流产者及４４例中晚期妊娠孕妇血清抗精子抗体（ａｎｔｉｓｐｅｒｍａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡｓＡｂ）进行研究。结果发现，抗分子量８５０００、５１０００、３００００精子抗原的ＡｓＡｂ与不孕相关；抗分子量８５０００、７９０００、６９０００，５１０００精子抗原的ＡｓＡｂ与女性不孕相关；不孕女性ＡｓＡｂ种类（在Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ上的反应条带数）明显多于生育女性。抗分子量８５０００、７９０００、５８０００精子抗原的ＡｓＡｂ与女性ＲＳＡ相关。本研究未发现不孕组男性、流产组男性及中晚期妊娠孕妇各种分子量精子抗原的ＡｓＡｂ检出率与生育组同性别相比有显著不同。所发现的这些ＡｓＡｂ可能与不育有密切关系，需要进一步研究和证实。

胰吸虫与肝片形吸虫成虫抗原的酶联免疫印迹分析

用SDS-PAGE和酶联免疫印迹试验(ELIB)分析胰吸虫成虫(EP)及其与肝片形吸虫成虫(Fh)交叉/共同抗原的分子量和免疫活性。SDS-PAGE结果显示,胰吸虫和肝片形吸虫成虫抗原的多肽均达30余条,EP抗原分子量在123kd以下,主带4条;Fh抗原分子量在83kd以下,主带4条;两者具相同分子量的多肽6条。ELIB结果显示,抗原与同源抗血清呈现颜色较深、数量较多的区带,而与异源抗血清则呈现数量不等的交叉/共同反应区带,表明两虫之间存在交叉/共同抗原性多肽。

非小细胞肺癌组织MAGE-1蛋白的Western印迹分析

目的检测黑素瘤抗原-1(MAGE-1)蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达,探讨以该蛋白作为疫苗对NSCLC患者进行免疫治疗的可能性。方法采用Western印迹法对3种人肺癌细胞系和56例NSCLC标本及相邻正常肺组织标本MAGE-1蛋白的表达情况进行研究。结果3种人肺癌细胞系均表达MAGE-1蛋白;56例NSCLC标本中,25例表达MAGE-1蛋白,而相邻正常肺组织均不表达。结论MAGE-1蛋白在NSCLC中呈高频率表达,提示该蛋白有望成为对NSCLC患者进行免疫治疗的适宜靶点。

抗精子抗体相关精子膜抗原的免疫印迹分析

目的 筛选抗精子抗体相关的精子膜抗原。方法 使用ELISA试验检测不育病人血清的抗精子抗体,选取抗精子抗体阳性血清,通过免疫印迹的方法来筛选抗精子抗体相关精子膜抗原。结果 通过ELISA试验共收集到抗精子抗体阳性男子血清标本18份、女子血清标本15份。有8种分子量的精子膜抗原被抗精子抗体阳性血清所识别,其中78KD、60KD、51KD、23KD的精子膜抗原的识别率较高,分别为71.43％、60.71％、14.29％和14.29％。结论 78KD、60KD、51KD、23KD的精子膜抗原与抗精子抗体的生成和免疫不育密切相关。

肺结核病人血清对分枝杆菌胞膜抗原的免疫印迹分析

SDS提取的三型分枝杆菌胞膜抗原经SDS-PAGE分析,所得组分复杂,结核分枝杆菌(H_(27)Rv株)为21～25条带,牛型分枝杆菌(BCG株)为22～29条带、鸟型分枝杆菌为21～23条带,其中前二者似带率最大;用肺结核病人强阳性抗体及中阳性抗体血清对三型抗原免疫印迹分析,证实35kD左右是三型菌的主要共同抗原,而结核分枝杆菌的60kD及40kD是其区别于其余二型菌的特异抗原组分。

正常人血清中IgG类抗角蛋白自身抗体的免疫印迹分析

目的了解作为正常人天然自身抗体一部分的抗角蛋白自身抗体群的免疫化学特性。方法用一组角蛋白对正常人血清IgG抗角蛋白抗体进行了免疫印迹分析。结果所分析的21份正常人血清均可识别至少一种角蛋白成分，可区分出14种反应性模式。3份合并血清的匣应性模式高度均一。结论血清抗角蛋白抗体普遍存在，但对角蛋白的反应性在人群中呈高度异质性。不同个体血清可互补。角蛋白一抗角蛋白系统可能是天然自身抗体研究的一个理想摸式系统。

非同位素PCR及Southern印迹杂交分析检测脆性X综合征FMR-1基因突变

目的 建立一种非同位素的检测脆性X综合征智力缺陷基因(FMR - 1)突变的方法。方法 采用PCR技术结合Southern印迹杂交技术对FMR - 1基因进行分析,进而确定其突变类型。结果 共对190例样本进行了检测,其中2例为女性前突变携带者,1例为女性全突变患者。结论 非同位素PCR方法可以简便、安全、可靠地检测FMR - 1基因中(CGG)n重复拷贝数,可作为临床上对脆性X综合征的筛查的首选方法;而非同位素Southern印迹杂交可对结果不确定者进一步进行检测。

Southwestern印迹图谱分析

Southwestern印迹图谱分折是近来研究DNA结合蛋白的理想方法,它可快速鉴定出DNA结合蛋白的分子量,还可确定基因组与蛋白质相结合的特异位置。 本文比较详细地介绍和讨论了核蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,再转至硝酸纤维素膜上,利用不同的DNA探针与其结合,最后通过分析结合的复合物,确定DNA结合蛋白及其结合位置等操作步骤及关键问题。

梭子蟹过敏原致敏组分的分析研究

目的应用免疫印迹(Western blotting)的方法分析梭子蟹[Portunus pelogicus(Linnaeus)]的致敏组分,为蟹过敏原的纯化和标准化变应原疫苗的研制提供理论依据。方法取常规方法制备的梭子蟹浸出液,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,用考马斯亮蓝染色分析其抗原蛋白的组分,同时用对蟹过敏的病人血清进行免疫印迹。结果SDS- PAGE显示梭子蟹可辨有19条蛋白带,分子量在13kD-90kD之间,其中主带有9条,分子量是20.9kD、24.2kD、27.1kD、29.2kD、33.7kD、38.9kD、48.7kD、74.7kD、89.1kD。Western blotting结果表明,16例蟹过敏患者血清全部呈阳性反应,浸出液中共有5条致敏条带,其中分子量在74.4kD、48.7kD的是主要致敏组分,阳性反应率均为100%。结论梭子蟹74.4kD和48.7kD组分为主要过敏原。

采用Western blotting的方法分析蚕蛹致敏原成份

目的 应用Western blotting的方法检测蚕蛹（silkworm chrysalis）浸出液中致敏原的成份，为蚕蛹致敏原的研究和临床诊断提供依据。方法取蚕蛹浸出液，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离，再转印到PVDF膜上，封闭后将血清与膜条共同孵育，后与辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgE抗体反应，显色底物用对氨基联苯胺。结果SDS-PAGE显示蚕蛹可辨条带有12条，分子量在14～94kD之间，其中主带有8条，分子量依次为80kD、68kD、62kD、50kD、29kD、23KD、18kD、16kD。Western blotting结果表明，22例蚕蛹过敏患者血清全部呈阳性反应，浸出液中共有6条致敏条带，其中分子量68kD和29kD是主要致敏组份，阳性反应率均为100％。结论蚕蛹分子量68KD和29kD的组份为主要致敏组份，结果可为开发适舍我国特色的蚕蛹变应原提供依据。

中国绿水螅抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆、抗体制备及表达分析

为探讨中国绿水螅(Hydra sinensis)抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)基因的起源及功能,研究采用RACE方法克隆了中国绿水螅APX基因的全长cDNA序列。该cDNA序列总长1357 bp,包括5′非编码区107 bp,3′非编码区146 bp及开放阅读框(Open reading frame,ORF) 1104 bp,共编码367个氨基酸,预测蛋白质分子量为40.79 kD。BLAST结果表明中国绿水螅APX蛋白同源序列绝大部分来自植物界;通过最大似然法(Maximum-likelihood)和贝叶斯分析(Bayesian inference)进行的系统发生分析显示植物界及动物界物种的APX序列各自形成单系群。把APX基因ORF全长序列克隆到原核表达质粒pET-GST中,重组质粒转化E.coliBL21 (DE3)菌株,IPTG诱导后成功表达重组融合蛋白GST-APX,再使用纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体用于APX蛋白的免疫印迹分析(Western blotting assay,WB)。在不同光照时长梯度(光强度2000 lx,每天分别光照0、4h、8h、12h、16h、20h及24h)下培养中国绿水螅30d,实时定量PCR (Quantitative real-timePCR,qPCR)及WB检测结果均表明光照时间较长时(每天光照12h以上)绿水螅APX表达呈现一定程度的上调。在长时间光辐射下水螅体内共生绿藻连续进行光合作用所累积的大量活性氧能够扩散到水螅细胞内,此时水螅体内表达上调的APX可能参与清除其细胞内的活性氧。

法国梧桐花粉的部分纯化及其主要变应原免疫活性分析

目的 对法国梧桐花粉变应原进行部分纯化并对其主要变应原免疫活性进行分析。方法 采用凝胶层析法分离纯化法国梧桐花粉变应原 ,经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测收集到的主要峰段的蛋白质分子质量 ,并对 7例法国梧桐花粉过敏支气管哮喘患者血清进行免疫印迹分析。结果 法国梧桐花粉变应原粗制液经SephadexG 10 0层析柱洗脱得两个洗脱峰 ,第一峰及第二峰升段富含蛋白 ;收集各段进行SDS PAGE电泳 ,第一峰升段、峰段、降段电泳图相似 ,主要含分子质量为 2 2～ 71ku之蛋白质 ,第二峰升段以分子质量为 14～ 16ku之蛋白质为主。电泳结果清晰显示 6条蛋白区带 ,分子质量分别为 71、5 0、35、39、2 2、16ku。免疫印迹分析可见 4条sIgG反应带 ,分子质量为 5 0、39、2 2、16ku。结论 法国梧桐花粉变应原含 6种主要蛋白成分 ,第一峰蛋白质含量高 ,为主要致敏组分 ;第二峰蛋白质含量少 ,为次要致敏组分。

家蚕脂蛋白基因BmLp-c21的表达分析及蛋白质亚细胞定位

家蚕30 kD脂蛋白家族在家蚕的生长发育过程中具有重要的生理功能。从家蚕蛹cDNA文库中克隆到一条编码30kD蛋白质的基因cDNA序列,该序列全长2 803 bp,ORF为792 bp,编码含263个氨基酸残基的脂蛋白(low molecular 30K lipo-protein pBmHPC-21;GenBank登录号:Q00801),命名为BmLp-c21。将BmLp-c21克隆至原核表达载体pET-28a(+),转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达后通过亲和层析得到纯化的融合蛋白,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。亚细胞定位显示BmLp-c21主要存在于细胞质中,呈点状或者片状分布。通过实时荧光定量PCR和Western blotting方法,分别检测到家蚕不同发育时期和5龄幼虫不同组织中BmLp-c21 mRNA的转录水平与蛋白质的表达水平存在较大差异,在蛹期及5龄幼虫血淋巴中的mRNA转录水平和蛋白质表达水平最高。初步推测BmLp-c21在家蚕蛹的变态发育过程以及蚕体脂质的运输方面具有重要的功能。