间充质干细胞包裹人胰岛减轻即刻经血液介导的炎症反应的体外研究

目的探讨间充质干细胞(MSC)包裹胰岛对胰岛移植即刻经血液介导的炎症反应(IBMIR)的影响。方法将经示踪剂标记的MSC与人胰岛放入超低吸附培养皿,间隔0.5 h吹打混匀2次,之后置37℃、5%CO_(2)条件下孵育培养24 h,实现MSC包裹胰岛,并检测MSC包裹胰岛的效果及胰岛的体外功能。体外构建血液循环管型模型,空白对照组加入0.2 mL胰岛培养液,胰岛组加入800胰岛当量未包裹的胰岛,MSC包裹组加入800胰岛当量MSC包裹的胰岛,37℃条件下循环60 min。在0、30、60 min 3个时间点各取0.5 mL血液进行血常规检测。循环60 min后将血液用70μm滤网过滤,收集血浆、血凝块及胰岛。血凝块及胰岛进行苏木素-伊红(HE)染色免疫组织化学(免疫组化)染色,观察组织形态学改变及CD11b阳性细胞在胰岛周围聚集情况。使用酶联免疫吸附试验检测血浆中凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)、组织因子(TF)、C3a、C5b-9、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、IL-8含量。结果MSC和胰岛共同孵育24 h后胰岛可以被MSC包裹,包裹程度约80%。胰岛组和MSC包裹组血凝块和胰岛周围均存在较多中性粒细胞和单核细胞,MSC包裹组较胰岛组CD11b阳性细胞少。与全血共孵育0、30、60 min后,MSC包裹组和胰岛组血小板、中性粒细胞和单核细胞数量均下降,且随着时间延长逐渐减少。与空白组比较,MSC包裹组血小板、单核细胞、中性粒细胞数量较少,TF含量较高;与胰岛组比较,MSC包裹组血小板、单核细胞、中性粒细胞数量较多,TAT、TF含量较低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与空白组比较,MSC包裹组C3a、C5b-9、IL-6、TNF-α、IL-8表达水平较高;与胰岛组比较,MSC包裹组C3a、C5b-9、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8、MCP-1表达水平较低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论MSC包裹胰岛可通过减少胰岛TF在血液中的暴露,在凝血反应阶段减轻IBMIR,从而减少移植早期胰岛移植物的损伤和丢失。

胰岛移植即刻经血液介导的炎症反应应对策略

胰岛移植作为治疗1型糖尿病和终末期2型糖尿病的有效手段,可以使患者获得较好的血糖控制能力。即刻经血液介导的炎症反应(IBMIR)是胰岛移植早期出现的非特异性炎症反应,发生后可迅速出现凝血级联和补体系统激活、炎症细胞聚集等,造成大量移植胰岛丢失,严重影响胰岛移植的疗效。如何减轻IBMIR对胰岛造成损伤是目前胰岛移植的研究热点,临床推荐的治疗胰岛移植IBMIR的药物有肝素和肿瘤坏死因子-α抑制剂依那西普。新近研究表明多种方法和药物可以减轻IBMIR对胰岛的损伤,本文就这些临床研究成果和临床前研究成果进行综述,以期为胰岛移植IBMIR的应对提供参考。

胰岛移植术后立即经血液介导的炎症反应机制

目的初步探讨胰岛移植术后立即经血液介导的炎症反应(instant blood-mediated in-flammatory reaction,IBMIR)的发生机制。方法Wistar大鼠,雌雄不限,体重为250～300g,分离、纯化胰岛,建立体外循环模型,于37℃下循环反应60min后加入胰岛800当量模拟IBMIR,分别于循环前、加入胰岛前、加入胰岛后5min、15min、30min、60min后留取血液行血常规检测,用酶标法检测血浆凝血酶-抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombin complex,TAT),并用酶联免疫吸附法检查血浆补体3a(C3a)含量。循环60min后取过滤残余血栓和组织行形态学检查。结果加入胰岛体外循环60min后血液中的血小板几乎全部耗竭,白细胞及单核细胞减少亦较为明显,但淋巴细胞比例变化不明显。血浆中的TAT、C3a含量随循环时间延长而增加。循环60min后的过滤残余的血栓块和组织中胰岛数量较少,结构破坏严重,被膜不完整,胰岛周围被微血栓包绕,大量中性粒细胞浸润。结论凝血反应、补体激活和白细胞激活可能是导致IBMIR的重要机制。

不同路径肝素对门静脉胰岛移植术后立即经血液介导炎症反应的影响

目的:临床上肝素主要作为抗凝药物使用,也具有一定的抗炎作用。目前糖尿病患者门静脉胰岛移植术后主要通过四肢的外周静脉而不是门静脉输注肝素,达到抗凝、保护移植物的目的。本研究采用动物实验探讨经门静脉与耳缘静脉输注肝素对门静脉胰岛移植术后立即经血液介导炎症反应(instant blood mediated inflammatory reaction,IBMIR)的影响,为临床胰岛移植手术抗凝方式的选择提供决策依据。方法:选择日龄3~5 d新生猪(Xeno-1型)50只,取出胰腺后分离并提纯胰岛。选择1.5~2.0月龄非糖尿病模型长白猪10只作为受体,外科手术暴露门静脉,将新生猪胰岛(12000 IEQ/kg)通过门静脉移植于长白猪肝脏。移植术前10 min所有受体均团注肝素50 U/kg,团注肝素后实验组通过门静脉输注肝素[10 U/(kg·h),5只]、对照组通过耳缘静脉输注肝素[10 U/(kg·h),5只]。分别于术前、术后1、3及24 h采集两组动物上腔静脉血液,实验组于术后1、3 h采集门静脉血液。检测实验组与对照组术前、术后1、3 h上腔静脉血液补体C3a、C5a、凝血酶-抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombin complex,TAT)、β-血小板球蛋白(β-thromboglobulin,β-TG)和D-二聚体(D-dimer)水平,以及活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT);检测术后1、3 h实验组门静脉、上腔静脉血液抗Xa(anti-Xa)、抗IIa(anti-IIa)水平。术后24 h取两组动物肝组织行病理检查,观察肝内胰岛炎性细胞浸润和周围血栓的形成情况。结果:实验组与对照组术前C3a、C5a、TAT、β-TG、D-dimer水平及APTT的组间差异均无统计学意义(均P>0.05)。术后1、3 h实验组C3a、TAT及D-Dimer水平均低于对照组,术后3 h实验组C5a低于对照组(均P<0.05)。术后1、3 h实验组门静脉血液anti-Xa、anti-IIa水平均高于上腔静脉(均P<0.05)。病理结果显示肝血管内存在胰岛细胞团。实验组胰岛周围少量血栓形成、少量中性粒细胞浸润;对照组胰岛周围明显有血栓形成和较多的中性粒细胞浸润。结论:门静脉输注肝素与耳缘静脉输注肝素比较,门静脉直接输注肝素对补体系统、凝血系统激活及炎性细胞浸润具有一定的抑制作用,在一定程度上可以缓解IBMIR的发生。

猪胰岛细胞异种移植激活立即经血液介导炎症反应的体外模型构建

背景:胰岛移植中,胰岛移植物的早期大量丢失是由于立即经血液介导的炎症反应损伤所致。要深入研究立即经血液介导的炎症反应的机制和抑制方法,稳定和标准化的立即经血液介导的炎症反应体外模型是不可或缺的研究平台。目的:观察成体猪胰岛移植物在异种移植体外模型中激活立即经血液介导炎症反应的表现,探索一种异种细胞移植立即经血液介导的炎症反应体外模型的稳定建模方法。设计、时间及地点:体外对比观察实验,于2008-01/11在中南大学湘雅三医院细胞移植与基因治疗中心实验室完成。材料:新鲜全血来源于体检血型为O型的健康志愿者,分为空白组、对照组、实验组。湖南沙子岭猪由中南大学湘雅医学院动物部提供。方法:以酶消化法结合密度梯度离心法分离纯化胰岛细胞。将5000胰岛当量和10000胰岛当量成年猪胰岛分别与实验组人新鲜全血混合加入肝素化的管道,使Loops管内新鲜血液中肝素的最终质量浓度分别为0.001,0.01,0.02g/L。Loops管固定于钟摆式摇床中摇摆5,10,60min模拟血液在体内血管的流动。空白组健康人新鲜全血抽出后立即作检测,对照组健康人新鲜全血7mL混合100μL培养液摇摆60min。主要观察指标:检测血常规、血液中人补体片段、人末端补体复合物、凝血酶抗凝血酶复合物、血小板球蛋白的变化,称凝血块的质量,并对其行苏木精-伊红染色病理检测。结果:TubingLoops内肝素质量浓度为0.001g/L时对新鲜全血的正常生理功能影响最小,可以长时间模拟体内血液生理功能不变。血液样本加入成体猪胰岛以后,10000胰岛当量实验组于10min开始出现了血凝块,随时间的延长,凝血块逐渐增大,TubingLoops管中血液的血小板数量随时间延长而减少,血小板球蛋白、凝血酶抗凝血酶复合物、血浆中人补体片段、人末端补体复合物明显增加,淋巴细胞、单核细胞被大量消耗,较5000胰岛当量实验组变化明显。血凝块病理学检测显示,胰岛细胞周围被血栓包围,其周边及血栓内均可见中性白细胞浸润,胰岛移植物表面包膜被破坏,出现裂解征象。结论:采用10000胰岛当量成年猪胰岛加至健康人新鲜全血的内表面0.001g/L肝素化管道,固定于钟摆式摇床中可以建立稳定、标准化的立即经血液介导的炎症反应体外模型。

超声分子靶向显像体外胰岛移植立即经血液介导的炎症反应

目的:探讨采用赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(Lys-Gly-Asp-Ser,KGDS)血栓靶向超声造影剂显示体外胰岛移植立即经血液介导的炎症反应(immediately blood-mediated inflammatory reaction,IBMIR)可行性,为无创、实时、动态地研究和评价IBMIR探索一种新的分子影像学方法。方法:7 m L新鲜全血+1 000胰岛当量(islet equivalent quantit y,IEQ)新生猪胰岛体外制作IBMIR模型。实验分为3组,均重复3次:A组对照组,不加造影剂;B组加普通超声造影剂;C组加靶向超声造影剂。将上述各组Loops管道固定于摇床,并浸于37℃的水浴中。采用超声造影模式实时观察Loops管内的回声,记录超声发现血栓出现的时间;并采用Line成像模式存储在硬盘,脱机分析血栓超声增强强度。实验开始后10,30,60 min 3个时间点,经70μm过滤网过滤Loops管内血液,测定过滤液体的凝血系统[凝血酶抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombin complex,ATA),D-二聚体(D-dimer)]、补体系统(C3a,C5b-9)及胰岛素含量等指标,过滤网内血块做病理学检测。结果:A组没有加入造影剂,超声不能发现血栓形成;B组、C组加入超声造影剂后超声可以发现血栓,其中B组加入自制普通超声造影剂,血栓在超声图像上显示为周边及内部无增强,呈充盈缺损改变,发现血栓时间为(7.3±0.5)min,相应血栓超声增强强度的灰阶值为31.22±3.56;C组加入靶向超声造影剂,超声清晰显示环状增强的血栓,发现血栓时间为(13.2±0.6)min,其超声增强强度的灰阶值为75.85±5.21。B组、C组血栓灰阶值及发现时间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。血液学检测证实各实验组均发生了IBMIR;病理结果显示胰岛与新鲜全血接触后,其表面形成血栓壳,加入带荧光的靶向超声造影剂,荧光显微镜可以清楚观察到胰岛周边呈明亮的荧光光环,与血栓壳位置、形态、范围完全吻合。结论:超声分子影像技术可以靶向显像体外IBMIR,为无创评估IBMIR的发生及其范围、程度提供了可能。

胰岛移植后立即经血液介导的炎症反应的治疗进展

目前,应用于临床的两类胰岛移植是治疗1型糖尿病患者的同种异体胰岛细胞移植和治疗难治性慢性胰腺炎全部或部分切除患者的自体胰岛细胞移植[1-2]。肝脏是胰岛移植的首选部位,一般通过静脉注射输注胰岛细胞[3]。一些患者胰岛移植后脱离胰岛素治疗,但这一结果是短暂的,大多数患者仍需使用外源性胰岛素[4]。

胰岛细胞移植后发生立即经血液介导的炎症反应的机制

在胰岛细胞移植的过程中,当其一接触受体血液即会引发立即经血液介导的炎症反应(IBMIR),使胰岛细胞迅速破坏失去分泌胰岛素的功能,笔者就IBMIR发生机制所涉及的问题,包括凝血系统的激活、补体系统的激活和抗体的作用、炎症介质和炎症细胞的浸润以及葡萄糖毒性的作用等作一综述。

胰岛-内皮细胞复合体对IBMIR的影响

目的探讨胰岛-内皮细胞复合体能否显著减轻立即经血液介导的炎症反应(IBMIR)。方法本实验将雄性Wistar大鼠分为3组:实验组、对照组、阴性对照组。结果实验组和对照组血浆中的抗凝血酶抗体(TAT)、补体C3a、血小板的数量在灌注后60分钟有明显差异(P<0.05)。结论胰岛-内皮细胞复合体并不影响胰岛的功能,能够显著减少胰岛移植初期的凝血激活、补体激活、血小板消耗,从而显著减轻IBMIR的反应,有可能成为临床胰岛移植中胰岛预处理的一种新方法。

胰岛保护和功能维护的研究进展

胰岛移植在糖尿病及其并发症的治疗中有很广阔的前景,但移植后功能不良、排斥反应和供体不足等是胰岛移植领域的瓶颈。优化胰腺保存方法对获取有效胰岛的数量及功能的维护有积极意义;在培养期间对胰岛进行抗排斥反应和抗凋亡处理,包括间充质干细胞(MSC)、MSC来源的外泌体、抗凋亡药物和基因修饰等可能成为临床胰岛移植胰岛保护与功能维护的重要方法;胰岛移植后抗立即经血液介导的炎症反应(IBMIR)药物的使用对于胰岛功能的保护也具有重要作用。本文围绕从胰岛制备到胰岛移植的全过程,探讨胰岛保护和功能维护相关策略,旨在为提升供体质量以弥补供体绝对数量的不足,提升胰岛移植效率提供参考。

尼克酰胺对人脐带间充质干细胞的保护效应

目的:探讨尼克酰胺(nicotinic acid amide,NAA)减轻人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UC-MSCs)输注损伤的效应。方法:空白对照组为0.3 m L生理盐水、MSC组为0.3 m L 1×106CFSE标记的h UC-MSCs,MSC+NAA组为0.3 m L 10 mmol/L NAA处理24 h的1×106CFSE标记的h UC-MSCs,分别与2.7 m L正常人全血混匀,注入改良Chandler Loop内,在37℃下,20 m L/min循环1 h,检测循环前后血小板、白细胞、h UC-MSCs和C3a的变化。结果:血小板消耗率空白对照组为(29.96±10.88)%、MSC组为(77.76±19.29)%、MSC+NAA组为(50.13±18.10)%;白细胞消耗率空白对照组为(37.82±13.81)%、MSC组为(64.57±17.08)%、MSC+NAA组为(41.52±17.26)%,MSC组和MSC+NAA组与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。MSC+NAA组的h UC-MSCs存活率较MSC组高(P<0.05)。空白对照、MSC和MSC+NAA组的C3a含量分别为(206.27±58.10)μg/L、(230.47±39.61)μg/L和(208.37±40.66)μg/L。结论:h UC-MSCs与正常人全血在改良Chandler Loop内共循环1 h可模拟血液介导即刻炎症反应(instant blood-mediated inflammatory reaction,IBMIR),大量损耗MSCs和血液成分,导致C3a上升。NAA可抑制IBMIR、降低血液成分的损耗、提高h UC-MSCs的存活率,提示NAA能减轻MSCs的输注损伤。

免疫球蛋白超家族细胞粘附分子在慢性肝病中的作用

细胞粘附分子(Cell adhesion moldlales，CAMs)是一类能介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质(ECM)相互牯附的糖蛋白，其种类繁多，作用非常广泛．在炎症反应、血液凝固、免疫识别、肿瘤的浸润及转移中起重要作用，它还参与跨膜信号的传递。本文就有关CAMs家族中免疫球蛋白超家族在慢性肝病中的作用作一简述。

胰岛移植临床技术操作规范(2019版)

为了进一步规范胰岛移植的临床技术操作,中华医学会器官移植学分会组织器官移植学专家从胰岛移植的适应证和禁忌证、供者胰岛制备及移植前处理、胰岛移植受者的术前检查和准备、胰岛移植植入术的技术操作规范、胰岛移植的术后处理、胰岛移植的免疫抑制方案、胰岛移植的并发症、胰岛移植的术后随访、自体胰岛移植等方面,制订本规范。

新生猪肾包膜下胰岛移植动物模型构建的初步研究

目的构建新生猪肾包膜下胰岛移植模型,探讨其可行性和潜在应用价值。方法选取9只野生型同胎新生健康杜洛克猪,其中1只为对照(p6307),6只为胰岛移植供体,2只为胰岛移植受体(p6210、p6207)。新生猪胰岛分离、体外培养分化后,行猪肾包膜下胰岛移植术,术后给予他克莫司(Tac)联合西罗莫司免疫抑制治疗。术后监测移植受体的体质量、血糖、血清肌酐水平,术后4周和8周分别处死受体新生猪p6210和p6207、对照新生猪,获取猪肾包膜下胰岛移植物进行病理学染色和胰岛素免疫荧光染色。结果猪肾包膜下胰岛移植术后,受体新生猪的体质量增长相对于对照新生猪明显减慢,并间断性伴有纳差、腹泻等症状;而受体新生猪的血糖、血清肌酐水平相较于术前及对照新生猪无明显变化。受体新生猪p6210肾包膜下可见明显的胰岛团块,病理学染色和胰岛素免疫荧光染色证实胰岛团块具有分泌胰岛素的功能,而受体新生猪p6207肾包膜下未见明显的胰岛团块,病理学染色未见明显胰岛团块,考虑该受体新生猪发生胰岛移植排斥反应导致胰岛定植失败。结论新生猪肾包膜下胰岛移植是可行的,为下一步构建用于异种移植治疗糖尿病终末期肾病的猪胰岛-肾复合供体器官提供前期铺垫。

表达人源补体调节蛋白hCD55对异种胰岛移植的保护作用

目的验证猪胰岛细胞上表达人类簇分化抗原55(hCD55)蛋白能否抑制人血清中补体成分的激活。方法选取4只基因型分别为WT(野生型)、GTKO[α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)基因敲除]、GTKO/hCD55和hCD55的成年猪,分离WT、GTKO、GTKO/hCD55猪胰岛细胞,检测其纯度及胰岛素分泌功能,通过琼脂糖凝胶电泳、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞术从DNA、RNA和蛋白水平检测hCD55的表达。在新鲜人血清孵育条件下,进行补体依赖的细胞毒性实验和补体沉积检测。结果分离得到的3种基因型猪胰岛细胞纯度>75%,糖刺激指数>1。GTKO/hCD55猪胰岛细胞上表达hCD55信使核糖核酸(mRNA)和hCD55蛋白,能够减少人补体C3c和攻膜复合物C5b-9的沉积,降低细胞毒性。结论猪胰岛细胞上表达hCD55蛋白能够抑制人补体激活,降低补体介导的杀伤作用,表明hCD55蛋白在猪胰岛细胞上可发挥补体保护效果,这为hCD55在异种胰岛移植中的应用提供了理论依据。