绵羊卵丘-卵母细胞复合体石蜡切片技术的改良

【目的】在绵羊有腔卵泡发育过程中,多层卵丘细胞紧密包绕着卵母细胞形成卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complex,COCs)特殊结构,存在于卵泡腔内。卵泡成熟后,绵羊COC从卵泡内排出,进入输卵管,等待受精。现有的卵丘-卵母细胞复合体蛋白鉴定技术,或者将包含各级卵泡的卵巢组织直接进行切片处理,或者将COCs从卵泡内分离,在完整卵丘-卵母细胞复合体水平上进行免疫染色。但这两种方法在检测绵羊有腔卵泡COCs中目的蛋白表达时,存在显著缺陷。研究旨在对常规石蜡组织切片技术进行改进,以期满足绵羊COCs蛋白鉴定需求。【方法】首先采用抽吸法从绵羊有腔卵泡内获得COCs,以石蜡包埋方式人为构建了一种可以进行切片处理的"包含多枚绵羊卵丘-卵母细胞复合体的仿组织结构"。然后以该特殊结构与健康绵羊卵巢组织为研究对象,分别采用改良与传统的石蜡组织免疫化学技术流程,检测了目的蛋白,尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator,uPA)与其受体(urokinase-type plasminogen activator recepter,uPAR),在绵羊COCs中的表达情况,比较了两种技术的免疫染色效果与染色流程差异。【结果】将所构建的绵羊COCs仿组织结构与正常绵羊卵泡组织,进行石蜡组织切片处理,经切片、贴片与脱蜡等步骤,分别形成了散在分布于载玻片上的COCs薄片与包含卵泡的卵巢组织薄层(厚度5μm)。经间接免疫染色处理后,结果显示:①目的蛋白在两种结构COCs中的表达是一致的,即uPAR在绵羊卵丘与卵母细胞上都有表达,而uPA只存在于绵羊卵丘细胞中;②在绵羊COCs薄片结构中,COCs整体形态完好,卵母细胞与外围卵丘细胞层次清晰,蛋白定位清楚,染色效果良好;在卵巢薄层结构中,绵羊卵泡内壁颗粒细胞与COCs等形态结构相对完整,卵母细胞蛋白定位清楚,但是卵丘细胞层次与蛋白表达较不清晰;③与绵羊卵巢组织石蜡切片技术相比较,绵羊COCs仿组织结构石蜡切片技术,在固定、脱水、透明、浸蜡以及脱蜡等步骤的处理时间都大大缩短,例如固定处理由24h缩短为2h;由逐级脱水的10h缩短为两级脱水的1h;透明由30min缩短为10min;软蜡与硬腊浸入由原来的6h缩短为1h;由逐级脱蜡的25min缩短为两级脱蜡的10min等。【结论】改进后的COCs仿组织石蜡切片染色技术,显示更优质的免疫定位与染色效果,不仅具有COCs获得率高、卵母与卵丘细胞形态层次清晰等优点,而且显著缩短了操作时间,简化了操作流程。该技术在保留COCs结构完整的基础上,有效检测了目的蛋白在绵羊卵丘-卵母细胞复合体中的表达模式,对于探明绵羊卵泡发育与卵母细胞成熟机制,具有重要意义。

小鼠成熟卵丘-卵母细胞复合体蛋白质谱图的建立

目的通过聚丙烯酰胺二维凝胶电泳技术,全面展示小鼠成熟卵丘卵母细胞复合体(COC)的蛋白质表达谱。方法采用13cmpH3～10的非线性胶条进行双向凝胶电泳,分离成熟雌鼠COC总蛋白,并作质谱鉴定。结果获得了较高分辨率的小鼠成熟COC蛋白质表达谱图,并对胶上的3个蛋白点进行了质谱鉴定。结论蛋白质组学是全面分析COC蛋白表达的有效手段。成熟COC蛋白质表达谱的建立为研究卵泡发育机理提供了依据。

TSG-6和连接蛋白在小鼠卵丘-卵母细胞复合体的共位性分析

目的：探讨小鼠卵丘-卵母细胞复合体(COC)中 TSG-6和连接蛋白(LP)与透明质酸(HA)的相关性。方法：应用激光扫描共聚焦显微镜和免疫荧光双重染色技术观察小鼠 COC 中 TSG-6和 LP 的表达和分布。结果： TSG-6和 LP 在 COC 中呈阳性表达。结论：TSG-6和 LP 的阳性表达可能和 HA 在 COC 成熟中起重要作用。

牛卵丘细胞对卵母细胞体外成熟与孤雌发育的影响

试验以牛卵泡内卵丘-卵母细胞复合体(COCs)为材料,探讨了牛卵丘细胞包裹程度对卵母细胞体外成熟(IVM)和孤雌胚胎(PAEs)发育的影响。试验1,将COCs随机分为2组,在开展IVM前,将其中一组COCs的卵丘细胞机械吹打去除成为机械裸卵(DOs),研究卵丘细胞层存在与否对卵母细胞体外核成熟(排出第一极体)和孤雌激活后发育能力的影响;试验2,根据COCs卵丘细胞包裹层数将COCs分为3组,即卵丘细胞层少(1～4层)的COCs为A组、卵丘细胞层多(5层以上)的COCs为B组及包裹5层以上卵丘细胞且附带卵泡壁颗粒细胞层(FSP)的COCs为C组,研究卵丘细胞层包裹程度对卵母细胞的体外核成熟和孤雌激活后胚胎发育能力的影响。结果表明:卵丘细胞的存在更有利于卵母细胞体外成熟和孤雌胚胎发育;COCs中卵丘细胞包裹层数对卵母细胞体外核成熟率没有显著影响,但包裹卵丘细胞层数多且附带FSP的卵母细胞,其PAEs的囊胚率显著高于包裹卵丘细胞少的卵母细胞PAEs。

猪体外成熟卵母细胞的卵丘扩散与胚胎发育能力的相关性

目的 探讨卵母细胞体外成熟过程中卵丘扩散与其体外受精后胚胎发育能力的关系。 方法 取猪卵丘 卵母细胞复合体 (COCs)在体外进行成熟、受精和培养 ,在体外成熟培养液中添加不同直径卵泡 (<2 ,2～ 5和 >5mm)的不同浓度 (15%、5% )卵泡液。 结果 在含卵泡液的成熟培养液中培养 48h ,卵泡液明显抑制了COCs的卵丘扩散 (P <0 .0 5) ,但不影响第一极体的排出 ;COCs成熟培养 2 4h后 ,移入不含卵泡液的成熟培养液中继续培养 2 4h ,卵丘扩散显著高于对应的 48h培养组 (P <0 .0 5) ,但第一极体的排出率无显著差异 ;体外成熟过程中COCs扩散的卵丘面积与其受精后的胚胎发育能力 (发育到 2～ 4细胞、>4细胞和桑葚胚 /囊胚的百分率 )呈显著正相关 (P =0 .0 0 58,0 .0 0 0 1和 0 .0 3 4 8)。 结论 卵泡液对COCs的卵丘扩散有抑制作用 ,这种抑制作用与卵泡液的作用时间相关 ;

猪分级卵母细胞体外成熟时间规律的研究

试验根据猪卵丘-卵母细胞复合体（COCs）的颗粒细胞层数,把COCs分成A、B、C和D级,A、B级用于体外分别培养24、32、38、44、48和54 h,C级用于体外分别培养24、32、38、44、48、54和60 h,观察它们不同时间排出极体数,然后将排出极体的卵母细胞孤雌激活。结果发现,A和B级COCs培养48 h时成熟率最高（83.2%和78.0%）,明显高于同级水平培养24、32和38 h的成熟率;不同级别COCs体外培养相同时间,A与B级成熟率差异不显著（P〉0.05）,但二者与C级的成熟率差异显著（P〈0.05）;体外培养48 h COCs卵裂率最高（81.7%）,与培养38 h前的卵裂率差异显著（P〈0.05）。结果表明,A、B级卵母细胞更适于体外培养,能获得高的成熟率和卵裂率,COCs周围颗粒细胞对卵母细胞的成熟有显著影响;COCs培养38 h之前,部分虽能看到极体,但激活后卵裂率极低,说明卵母细胞并未真正成熟,通常通过排出极体判断卵母细胞成熟是不够准确的,COCs体外培养44~48 h是成熟的最佳时期,能为体细胞核移植提供大量优质的MⅡ期卵母细胞。

猪卵母细胞极体排出的规律

试验把猪卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte complexes,COCs)于体外分别培养24、32、38、44、48和54 h,观察它们在不同时间排出的极体数,以研究体外卵母细胞排出极体的规律。结果表明,A级和B级的COCs培养48 h的极体排出率最高(83.2%和65.7%),明显高于同级水平培养24、32和38 h的;不同级别COCs体外培养相同时间后,A级与B级的极体排出率差异不显著(P﹥0.05),但两者与C级的差异显著(P﹤0.05)。由此可见,A级、B级COCs能获得高的极体排出率,培养48 h的极体排出达到高峰,排出过程呈现前期上升快、后期下降慢的变化趋势。

卵巢储备功能减退患者卵泡液外泌体对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的探讨卵巢储备功能减退(DOR)患者卵泡液外泌体对小鼠卵母细胞体外成熟的影响,以期为女性因DOR导致的生育功能降低和不孕症的发生提供新的科学实验数据。方法选取SPF级4~6周龄C57BL/6J未孕雌性小鼠,收集未成熟卵母细胞并进行体外成熟培养;同时收集DOR患者卵泡液,并提取外泌体。利用Dio荧光标记外泌体后与小鼠未成熟卵丘-卵母细胞复合物(COCs)共孵育培养,观察外泌体摄入情况;通过添加不同浓度0、50、100和150μg/ml外泌体处理小鼠未成熟COCs 16 h观察卵丘扩展和第一极体排出情况,分析其对卵母细胞成熟的影响并筛选出最佳处理浓度;设置分组为体内成熟组(control)、外泌体添加组(exo+)和未添加组(exo-),各组成熟后的COCs利用qPCR检测卵丘扩展相关基因Has2、Tnfaip6和Ptgs2以及凋亡相关基因Bax、Bcl2的mRNA相对表达水平,分析各组间的差异。结果(1)Dio标记的外泌体与小鼠COCs共孵育,卵丘颗粒细胞上能观察到明显的Dio荧光信号,证实COCs能够摄入外泌体;(2)不同浓度外泌体处理组的GV期卵母细胞百分比均显著高于0μg/ml组(P<0.05),而MⅡ期卵母细胞百分比均显著低于0μg/ml组(P<0.05)。使用150μg/ml作为后续实验工作浓度;(3)qPCR的结果显示,小鼠COCs中卵丘扩展相关基因Has2的mRNA表达水平在体内成熟组及体外成熟培养组各组间的差异无统计学意义(P>0.05),exo+组和exo-组的Tnfaip6、Bcl2和Bax mRNA表达水平均显著低于control组(P<0.05或P<0.01),exo+组Ptgs2的mRNA表达水平显著低于control组(P<0.05);此外,exo+组Tnfaip6、Ptgs2和Bcl2的mRNA表达水平均显著低于exo-组(P<0.05或P<0.01)。结论DOR患者卵泡液外泌体能够抑制小鼠卵母细胞体外成熟过程中卵丘扩展和减数分裂恢复,并且显著抑制了卵丘扩展相关基因Ptgs2和Tnfaip6以及细胞凋亡抑制基因Bcl2的表达。

孕晚期人未成熟卵母细胞的体外成熟:一种新的卵母细胞来源

目的探讨来源于孕晚期、自然周期及Gn刺激周期(包括超促排周期及IVM周期)的人未成熟卵母细胞体外成熟的差异及颗粒细胞对孕晚期卵母细胞体外成熟的影响。方法共获得未成熟卵母细胞1076枚,包括OCC633枚和DO453枚。其中OCC分为孕晚期组、自然周期组和IVM周期组;DO分为孕晚期组、自然周期组和超促排卵周期组;孕晚期来源的未成熟卵母细胞分为OCC组和DO组。所有未成熟卵母细胞体外成熟后,ICSI受精序贯培养,除IVM周期组行胚胎移植外,其余均培养至囊胚阶段。分别比较OCC和DO各组未成熟卵母细胞的成熟率、受精率、卵裂率和孕晚期组、自然周期组和超促排卵周期组的囊胚形成率,统计IVM周期组的移植周期妊娠率;比较孕晚期OCC组与DO组的成熟率、受精率、卵裂率和囊胚形成率。结果OCC:孕晚期组、自然周期组及IVM周期组的体外成熟率分别为74.3%、76.9%和82.2%,孕晚期组与IVM周期组相比具有统计学差异;三组受精率、卵裂率相比,孕晚期组和自然周期组囊胚形成率相比均未见统计学差异,IVM周期组移植周期妊娠率为20%。DO:超促排卵周期组体外成熟率最高(86.0%),明显高于自然周期组(72.5%)和孕晚期组(72.7%),P<0.01;孕晚期组受精率、卵裂率、囊胚形成率分别为65.0%、83.3%和38.5%,与其他两组相比均亦未见统计学差异。孕晚期OCC组与DO组的成熟率、受精率、卵裂率和囊胚形成率无差别。结论孕晚期来源的未成熟卵母细胞在体外具有同样的发育潜能,孕晚期捐献的卵母细胞可作为一种供卵来源;有无颗粒细胞并不影响孕晚期卵母细胞的发育能力。

卵巢运输保存温度和时间对野生梅花鹿卵母细胞体外成熟的影响

以屠宰日本北海道野生梅花鹿（Cervus nippon Temminck）卵巢为材料，研究了卵巢不同保存温度（20～25℃，10～15℃）和时间（12h，24h）及卵母细胞周围的卵丘细胞层对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明，卵巢在20～25℃下保存12h，卵母细胞成熟率为77％，无变形卵子出现，但其保存时间延长到24h时，卵母细胞成熟率降至35％，变形率高达62％；而在10～15℃下保存12h，卵母细胞成熟率为45％，卵母细胞变形率为18％，但10～15℃保存24h与20～25℃保存24h相比，卵母细胞变形率却很低（35％，62％）（P〈0.05）。周围卵丘细胞层3层以上和少于3层的卵母细胞中，48％～53％的受精卵都能正常地卵裂，但前者获得了13％的囊胚率，后者未发育至囊胚（P〈0．05）。

绵羊卵母细胞体外培养实验研究

本实验采集的屠宰绵羊卵母细胞分两批。一批分别以10～15℃,20～25℃,30～35℃运输;另一批分别采用16～18h,20～22h,24～26h,28～30h的体外成熟时间进行实验。卵母细胞由长距离运输运回实验室,经体外受精观察其体外培养发育情况,从而为确立长途运输卵巢体外培养的条件提供必要的实验依据。实验结果显示:在不同运输温度的卵母细胞中,温度为20～25℃时卵母细胞能够进行较好的发育,卵母细胞的成熟率为64.86%,囊胚率为34.58%;在不同体外成熟时间的卵母细胞中,时间为20～22h时卵母细胞能够较好的发育,卵母细胞的成熟率为62.79%,囊胚率为31.70%。

卵丘细胞上AIFM2和FDX1的表达及其与小鼠卵母细胞成熟的关系

目的检测小鼠卵母细胞体外、体内成熟过程中卵丘细胞(CCs)上线粒体相关凋亡因子2(AIFM2)和铁氧化还原蛋白1(FDX1)的表达,探讨其在卵母细胞成熟中的作用。方法从3周龄ICR雌性小鼠获取体内成熟卵丘-卵母细胞复合体(IVV-COCs)以及GV期卵丘-卵母细胞复合体(GV-COCs),并将GV期体外培养至MⅡ期卵丘-卵母细胞复合体(IVMCOCs)。收集对应的CCs,分成GV-CCs、IVM-CCs和IVV-CCs 3组。实时定量逆转录聚合酶链反应检测AIFM2和FDX1mRNA水平的表达,以GAPDH为参照;激光共聚焦免疫荧光技术观察COCs的AIFM2和FDX1的亚细胞定位。结果IVM-CCs和IVV-CCs的AIFM2mRNA相对表达量[分别为(0.72±0.01)和(0.67±0.02)]显著高于GV-CCs组[(0.10±0.06)](P<0.01);同样,IVM-CCs和IVV-CCs的FDX1mRNA相对表达量[分别为(1.58±0.35)和(1.82±0.34)]也显著高于GV-CCs组[(0.10±0.03)](P<0.01);而IVM-CCs和IVV-CCs的AIFM2和FDX1表达水平均无显著性差异(P>0.05)。免疫荧光显示,AIFM2和FDX1主要定位于CCs胞质中,在GV-COCs中各层均有表达,且GV期卵母细胞中也有表达;IVMCOCs和IVV-COCs中表达阳性的细胞数目较GV期增加。结论卵母细胞成熟后,其CCs上AIFM2和FDX1的表达升高,表明AIFM2和FDX1参与了卵母细胞成熟过程,有望作为预测卵母细胞成熟的生物标记物。

CYP11A1在牦牛不同级别卵泡及卵母细胞成熟过程中的表达

目的:本研究旨在探索CYP11A1在牦牛卵泡发育过程及不同成熟阶段卵母细胞中的表达情况。方法:采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和免疫荧光技术(Immunofluorescence,IF)检测CYP11A1在不同级别卵泡(0~3 mm、3~5 mm、5~8 mm及大于8 mm)和不同阶段(未成熟、成熟12 h、成熟18 h及成熟24 h)体外成熟卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte complex,COCs)中的表达定位。结果:CYP11A1基因在不同级别的卵泡中均有表达,卵泡大小为3~5 mm时,表达量最高,随卵泡不断扩张呈低水平表达,卵泡大小大于8 mm时,基因的表达量降为最低;在未成熟的COCs中相对表达量最低,成熟12 h的COCs中表达水平达到最高值,之后又呈现先下降后升高的趋势。IF检测结果显示CYP11A1在卵丘、卵母细胞中均有表达。结论:CYP11A1参与牦牛卵泡的扩张和卵母细胞的成熟过程,该结果有助于进一步研究CYP11A1在牦牛雌性生殖中的作用机制。

多柔比星对体外培养小鼠腔前卵泡发育的影响

目的：利用雌性ICR小鼠腔前卵泡体外培养方法观察多柔比星对卵泡发育的影响，对多柔比星卵巢毒性机制进行初步探讨。方法：取12～14日龄的雌性ICR小鼠卵巢的腔前卵泡进行原代培养，在培养的第2、6和11X，分别用不同浓度的多柔比星（0．4、0．8、1．6和3．2μg／mL）染毒24hA继续培养。通过测量卵泡的大小、存活率和卵丘一卵母细胞复合体fcumulus—oocyte cell complexes，COCs）的排出率来判定多柔比星对腔前卵泡发育的影响。结果：在实验所设置的剂量范围内，与对照组比较，多柔比星在1．6和3．2μg／mL浓度下能明显抑制雌性ICR小鼠卵巢腔前卵泡的发育（P〈0．05），降低卵泡的存活率（P〈0．05），并抑制COCs的排出（P〈0．05），且呈一定的剂量效应关系。结论：多柔比星可抑制腔前卯泡的发育，降低卵泡的存活率，抑制COCs的排出，从而引起卵巢毒性，产生卵巢功能障碍。

未成熟卵母细胞在TCM199与P1培养体系体外成熟的比较

目的探讨人未成熟卯母细胞适宜的培养体系及培养时间。方法将卯母细胞-卵丘复合体（OCC）332枚和裸卯（DO）393枚随机置入TCM199和P1两种培养体系体外成熟。OCC体外培养48h，观察其成熟情况。DO分别在24、30、48h观察第1极体排出情况，计算体外成熟率。OCC和DO成熟后称为成熟的卵母细胞，成熟的卯母细胞行精子卵浆内注射技术（ICSI）受精，比较其在两种培养体系的受精率、卯裂率及囊胚形成率。结果在TCM199和P1培养体系中，OCC的成熟率、成熟后成为成熟的卵母细胞的受精率和卵裂率的差异无统计学意义（P均〉0．05），但成熟的卯母细胞的囊胚形成率为53．7％比37．8％（P〈0．05）。DO在TCM199和P1培养体系中体外培养24、30、48h时成熟率的差异无统计学意义；由DO成熟后形成的成熟的卵母细胞在P1培养体系中的受精率、卵裂率和囊胚形成率高于其在TCM199培养体系中，但只有受精率差异具有统计学意义（73．5％比62．9％，P〈0．05）；DO在两种培养体系中体外培养48h和30h的成熟率均明显高于24h（P〈0．05），但48h与30h的成熟率相比无差异。结论OCC适宜在TCM199培养体系的培养；DO适宜在P1培养体系的培养。DO体外成熟形成成熟的卯母细胞的时间可以缩短至30h。

基于PI3K/AKT/mTOR信号通路研究补肾法对体外培养小鼠卵母细胞成熟的促进作用

目的研究补肾法对体外培养小鼠卵母细胞成熟的促进作用及其与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)信号通路的关系。方法给6~8周龄雌性大鼠灌服补肾调经Ⅲ号方制备含药血清。将3~4周龄雌性小鼠随机分为A、B组,A组灌胃蒸馏水,B组序贯灌胃补肾调经系列方(Ⅱ号方和Ⅲ号方),各灌胃12 d。第11天腹腔注射孕马血清促性腺激素(5 IU/只),48 h后剥离卵巢,取出卵丘-卵母细胞复合体(COCs)进行体外培养。将A组COCs分为空白对照组和抑制剂组(25μmol/L LY294002),B组分为补肾组(10%补肾调经Ⅲ号方含药血清)和补肾加抑制剂组(10%补肾调经Ⅲ号方含药血清+25μmol/L LY294002)。体外培养18 h后,在显微镜下统计各组第一极体排出量并计算排出率。收集COCs, RT-PCR法检测各组COCs中Bcl-2、Bax、PI3K、AKT、mTOR mRNA的表达,免疫荧光染色法检测各组COCs中Bcl-2、Bax、PI3K、AKT、mTOR、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的蛋白表达。结果第一极体排出率补肾组高于空白对照组(P<0.05),抑制剂组低于空白对照组(P<0.05),补肾加抑制剂组低于补肾组(P<0.05)。RT-PCR结果显示,与空白对照组比较,补肾组COCs中Bcl-2、PI3K、AKT、mTOR mRNA表达及Bcl-2/Bax值均升高(P<0.05),Bax mRNA表达降低(P<0.05);抑制剂组COCs中Bcl-2、PI3K、AKT、mTOR mRNA表达及Bcl-2/Bax值均下降(P<0.05),Bax mRNA表达升高(P<0.05)。与补肾组比较,补肾加抑制剂组COCs中Bcl-2、PI3K、AKT、mTOR mRNA表达及Bcl-2/Bax值均降低(P<0.05),Bax mRNA表达升高(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示,各组间PI3K、AKT、mTOR蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与空白对照组比较,补肾组COCs中Bcl-2蛋白表达、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT升高(P<0.05),Bax蛋白表达降低(P<0.05);抑制剂组COCs中Bcl-2蛋白表达、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR降低(P<0.05),Bax蛋白表达升高(P<0.05)。与补肾组比较,补肾加抑制剂组COCs中Bcl-2蛋白表达、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR降低(P<0.05),Bax蛋白表达升高(P<0.05)。结论补肾调经系列方可通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路、上调Bcl-2和Bax mRNA及蛋白表达的比值、抑制COCs凋亡从而促进小鼠卵母细胞成熟。

猪卵泡内促卵丘扩展因子的来源

猪卵丘的扩展不依赖于卵母细胞,因此推测,猪卵母细胞可能不是卵泡内促卵丘扩展因子（cumulus expansion enabling factor,CEEF）的惟一来源,实验应用小鼠摘除卵母细胞的卵丘-卵母细胞复合体（oocytectomized complex,OOX）检验猪透明带、不同质量生发泡期卵母细胞以及卵泡内的其他细胞成分产生CEEF的情况。结果证明:（1）猪和小鼠的空透明带都不能产生CEEF。（2）猪不同质量（A,B,C三类）未成熟卵母细胞均能分泌CEEF,其分泌CEEF的能力和CEEF活性没有明显差异（P>0.05）.（3）猪3～6mm卵泡的OOX和小于1mm卵泡的颗粒细胞都有较高的CEEF分泌能力,且此能力不依赖于激素作用;但3～6mm卵泡的壁颗粒细胞不能分泌CEEF。（4）3～6mm卵泡的卵泡液中含有CEEF,但其活性与培养时所用的卵泡液浓度有关,浓度过高CEEF活性反而下降。（5）进行培养时必须添加促性腺激素,小鼠OOX才发生扩展,说明由猪卵母细胞和卵泡成分产生的CEEF的促卵丘扩展作用依赖于促性腺激素。

GDF-9对牦牛COCs体外成熟培养及其相关基因mRNA表达的影响

为探明生长分化因子-9(Growth differentiation factor 9,GDF-9)对牦牛卵丘-卵母细胞复合体(Cumulusoocyte complexes,COCs)体外培养的卵母细胞成熟率及相关基因mRNA表达水平的影响:采取健康牦牛的卵巢,分离COCs进行体外成熟培养;在牦牛COCs成熟培养液中添加终浓度分别为0、200、400、600ng/mL的GDF-9,统计卵母细胞成熟率;采用Real-time PCR方法检测GDF-9处理的COCs中Smad信号通路下游分子Smad4以及卵丘扩展相关基因(HAS2、PTX3、PTGS2)的mRNA表达水平。结果表明:添加0、200、400、600ng/mL GDF-9的COCs成熟率差异不显著(P>0.05)。Smad4和卵丘扩展相关基因(HAS2、PTX3、PTGS2)的mRNA表达量随着GDF-9浓度升高呈上升趋势,其中600ng/mL GDF-9处理组的Smad4和PTX3mRNA表达量最高,与其他处理组差异显著(P<0.05);600ng/mL GDF-9处理组的HAS2、PTGS2mRNA表达量与400ng/mL GDF-9处理组差异不显著(P>0.05),与其他实验组差异显著(P<0.05)。研究发现,在牦牛COCs体外培养过程中,添加不同浓度的GDF-9对牦牛卵母细胞成熟率的影响差异不显著;GDF-9显著提高其信号通路下游分子Smad4基因以及卵丘细胞扩展相关基因(HAS2、PTX3、PTGS2)的mRNA表达,说明600ng/mL GDF-9对牦牛体外培养过程中卵丘扩展有作用,作用机制可能与激活Smad信号通路有关。

经后增殖方含药血清对超排卵大鼠卵巢COCs及CCs中GDF9与Bim表达的影响

目的观察经后增殖方含药血清对超排卵大鼠卵巢的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)及卵丘细胞(CCs)中生长分化因子9(GDF9)及Bim表达的影响,探讨其治疗效果及作用机制。方法制备大鼠超排卵卵巢模型,收集COCs和CCs,分别与雌性SD超排卵大鼠空白血清和经后增殖方药物血清在体外共同培养,各分3组:空白血清组(空白组)、含药血清组(对照组)、含药血清+GDF9受体阻断剂组(实验组),共6组。24h后收集COCs和CCs,实时荧光定量PCR检测GDF9和Bim mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测GDF9蛋白表达水平。结果 (1)对照组COCs中GDF9mRNA表达水平明显高于空白组和实验组(P<0.05);对照组和实验组COCs中Bim mRNA表达水平均明显低于空白组(P<0.05);对照组COCs中GDF9蛋白表达水平明显高于空白组(P<0.05),亦高于实验组,但差异无统计学意义(P>0.05)。(2)CCs中GDF9mRNA表达水平在3组间的差异性比较结果与COCs中一致;对照组和实验组CCs中Bim mRNA表达水平均明显低于空白组(P<0.05);对照组CCs中Bim mRNA表达水平明显低于实验组(P<0.05);对照组CCs中GDF9蛋白表达水平明显高于空白组和实验组(P<0.05)。(3)对照组COCs中GDF9mRNA表达水平明显高于CCs中(P<0.05),其余组内COSs和CCs比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论经后增殖方含药血清能提高COCs和CCs中GDF9的表达水平,维持COCs和CCs中Bim的低水平表达,抑制细胞凋亡,促进卵泡发育;COCs较剔除卵母细胞的CCs更有利于GDF9mRNA的表达。