6种杀虫剂对鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化率及致病力的影响

为评价杀虫剂用于球虫卵囊消毒的可能性,检测了丁硫克百威、氯虫苯甲酰胺、茶核苏云菌、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、辛硫灭多威和甲基硫菌灵对柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化率的影响。结果发现,氯虫苯甲酰胺0.3μL/m L处理组球虫孢子化率为61.25%,甲氨基阿维菌素苯甲酸盐1、3μg/m L和30μg/m L处理组球虫孢子化率分别为60%、63.75%和65%,均显著低于生理盐水处理组。进一步利用氯虫苯甲酰胺(0.3μL/m L)和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(1μg/m L)处理球虫孢子化卵囊1 h和24 h并接种鸡,各处理组抗球虫指数(ACI)均在100以上,高于生理盐水处理对照组(ACI=53.5),其中以甲氨基阿维菌素苯甲酸盐处理1 h组ACI值最高,达129.7。表明氯虫苯甲酰胺和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐能显著降低柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化率及致病力,具有用于鸡球虫卵囊消毒的可能性。

不同药物与消毒剂对免球虫卵囊孢子化的影响

目的 对比研究不同抗兔球虫药物与消毒剂对兔球虫卵囊孢子化过程的抑杀效果,为兔球虫病的防治提供参考.方法 分别选取5种抗球虫药物和消毒剂进行抑制试验,观察它们对兔球虫卵囊体外孢子化过程的影响.结果 （1）5种抗球虫药物对兔球虫卵囊孢子化抑制率大小依次为：百球清＞优求乐＞球抑＞球肠清＞肠球双效,半数效量（EC5o）大小依次为：肠球双效＞球肠清＞球抑＞优求乐＞百球清;（2）5种消毒剂对兔卵囊孢子化抑制率大小依次为：二硫化碳＞苯酚＞氨水＞三氯异氰尿酸＞碘酊,半数效量大小依次为：碘酊＞三氯异氰尿酸＞氨水＞苯酚＞二硫化碳;半数孢子化时间依次为：二硫化碳＞氨水＞苯酚＞三氯异氰尿酸＞碘酊.（3）毒力较强的几种兔球虫卵囊耐药性大小依次为：大型艾美耳球虫＞斯氏艾美耳球虫＞无残艾美耳球虫＞肠型艾美耳球虫.结论 15 mL/L百球清体外作用8h对兔球虫卵囊孢子化抑制效果最强.体积分数6％二硫化碳作用于卵囊4h,抑制兔球虫卵囊孢子化效果最好.兔球虫卵囊耐药性与虫体大小相关,较大虫体对药物敏感性高.

对氯间甲酚及复方对氯间甲酚对鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊的抑杀效果

为验证苯酚类消毒剂对鸡球虫卵囊的抑杀作用,采用不同浓度的单体和复方对氯间甲酚消毒剂与未孢子化的柔嫩艾美耳球虫卵囊共孵育,检测其对卵囊孢子化率的影响;与孢子囊共同孵育,通过子孢子脱囊率评价其对子孢子释放的干扰。孢子化卵囊经过不同浓度消毒剂直接浸泡、粪便干扰下浸泡或喷雾处理后经口接种雏鸡,通过OPG和盲肠病变记分探究消毒剂处理对卵囊的繁殖力和鸡的致病性的影响。结果显示,2种消毒剂均可使孢子化率和子孢子脱囊率显著下降,且3种浓度的复方对氯间甲酚与3%氨水对照组(PC)的消毒效果无显著差异。直接浸泡处理试验结果显示,2%和3%复方对氯间甲酚(HTS2和HTS3)具有更为显著的抑杀效果,与PC无显著差异;粪便干扰试验结果显示,粪便作用下这两种消毒剂对球虫卵囊仍有理想的抑杀效果;喷雾处理试验结果显示,3%对氯间甲酚(HT3)对球虫卵囊抑杀效果最好,显著优于PC组(P<0.05),而2%对氯间甲酚(HT2)、HTS2和HTS3组的抑杀效果与PC组无显著差异。研究结果表明,不同浓度下这2种消毒剂对孢子化和未孢子化的柔嫩艾美耳球虫卵囊都有一定的抑杀作用,综合比较,复方对氯间甲酚消毒剂具有更强的抑杀球虫卵囊效果,具有代替氨水成为鸡球虫消毒剂的潜能。

毒害艾美球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建

为构建毒害艾美球虫孢子化卵囊cDNA表达文库，用Trizol试剂提取毒害艾美球虫孢子化卵囊总RNA，采用SMART技术，在逆转录酶的作用下将总RNA反转录成第一链cDNA，经LD-PCR扩增合成双链cDNA（ds cDNA）。经蛋白酶K消化、SfiⅠ酶切，过CHROMA SPIN-400^TM柱去除小于400bp的片段，与λTriplEx2^TM噬菌体载体连接，用GigapackⅢGold^TM载体蛋白包装，构建了cDNA噬菌体表达文库。经测定，原始文库容量为4．72×10^6pfu／mL，扩增后的文库容量为2．62×10^10pfu／mL，重组率为97．5％，插入片段为500～1100bp。证实，该文库质量良好，为毒害艾美球虫新基因的筛选、克隆及功能研究奠定了基础。

柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建

用建立表达性文库的方法 ,构建了Eimeriatenella孢子化卵囊噬菌体ZAP表达性cDNA文库。首先用TRIzol试剂盒从E .tenella孢子化卵囊中提取总RNA ,再用Oligo(dT) 1 2 纤维素柱从总RNA中分离mRNA ,以mRNA为模板 ,Oligo(dT) 1 8Linker Primer为引物 ,反转录合成cDNA第一链 ,再在DNA聚合酶Ⅰ作用下置换合成第二链cDNA。cDNA第二链合成后用PfuDNA聚合酶补平XhoⅠ位点 ,再与EcoRⅠAdapters连接 ,经XhoⅠ酶切后 ,凝胶电泳回收 5 0 0bp～ 4 .0kp之间的cDNA片段 ,纯化后的双链cDNA与载体ZAPExpressvector连接。体外包装后得到E .tenella孢子化卵囊的cDNA表达性文库 ,经测定该文库的容量为 6× 10 6 ,扩增后文库的滴度为 1× 10 1 1 Pfu mL ,经PCR测定 ,该文库的重组率为 96%。

判断消毒剂对鸡球虫孢子化卵囊抑杀效果的新方法脱囊抑制试验

判断消毒剂抑杀鸡球虫孢子化卵囊的效果，一般要通过鸡体试验，即观察经消毒剂作用过的卵囊对健康鸡的致病力，以病变值、卵囊值、抗球虫指数等判定效果［１］。鸡体试验操作繁琐，试验时间长，且不能确定药物抑杀的百分率。我们参考文献［２，３］介绍的脱囊技术，总结出...

利用gateway技术构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA表达文库

[目的]为了寻找可用于研制高效重组疫苗的抗原基因,利用gateway技术构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA表达文库。[方法]首先从新鲜分离的巨型艾美耳球虫孢子化卵囊中提取总RNA并分离纯化mRNA,用Clone MinerTMⅡcDNA文库构建试剂盒构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA初级文库,然后将cDNA从初级文库重组到p VAX1.0上,构建巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA表达文库,最后用7个已知巨型艾美耳球虫基因的引物鉴定文库。[结果]构建的巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA初级文库总容量为0.92×107CFU,插入片段平均大小为1.63 kb;表达文库总容量为2.32×107CFU,插入片段平均大小为1.64 kb。两种文库的阳性重组率均为100%。能用特异性引物从该表达文库扩增出7个已知的巨型艾美耳球虫基因。[结论]该文库质量高,代表性强,为进一步筛选免疫保护性抗原基因奠定了坚实基础。

两种方法提取柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊基因组DNA的对比试验

为寻找一种合适的提取球虫基因组DNA的方法,试验采用氯化苄法(BC)和常规提取DNA的方法提取了鸡柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊基因组DNA。氯化苄的化学性质类似于苯酚,在65℃条件下与蛋白质和几丁质等发生反应,能够有效地破坏球虫卵囊壁,可用于大规模提取基因组DNA;常规方法提取DNA的程序是用蛋白酶K消化处理,用酚/氯仿抽提,再用氯仿抽提,部分步骤需要重复。2种方法对比试验结果表明,二者均可用于鸡球虫基因组DNA的提取,所获得的DNA数量和质量都很高,可用于各种分子生物学实验。但BC法具有简便、快速、经济实用的特点,更适用于球虫卵囊大量样品的DNA快速提取。

中药抗球散体外抗鸡球虫卵囊孢子化及抑菌抗炎作用研究

为了探讨中药抗球散的抗球虫、抑菌抗炎作用,试验采用试管二倍稀释法测定抗球散对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用;建立二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型,进行抗炎试验。结果表明:抗球散能够抑制鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化,并且随着药量的增加,抑制效果亦相应增强。经计算,抗球散高剂量组卵囊孢子化率比空白对照组降低77.34%,差异极显著(P<0.01),效果与地克珠利组相当;抗球散对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度(MIC)分别为31.25 mg/m L和62.5 mg/m L,最低杀菌浓度(MBC)分别为62.5 mg/m L和125 mg/m L;不同剂量的抗球散对二甲苯导致的小鼠耳廓肿胀皆有明显的抑制作用,并且随着剂量的增加,抗炎效果亦相应增强。经计算,抗球散高剂量组抑制率比空白对照组提高23.90%,差异显著(P<0.05),效果与盐酸多西环素组相当,说明中药抗球散具有较好的抗球虫及抑菌抗炎作用。

3株巨型艾美耳球虫免疫原性差异株未孢子化卵囊蛋白的SDS-PAGE分析

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(SDS-PAGE)比较分析了3株巨型艾美耳球虫免疫原性差异株未孢子化卵囊可溶性蛋白。结果显示,尽管所用的3株巨型艾美耳球虫在免疫原性上存在不同程度的差异,但3株巨型艾美耳球虫未孢子化卵囊可溶性蛋白的SDS-PAGE电泳图谱相似,至少有8条带,各带主次分明,其中有2条明显主带,分子量分别为42 000和39 000,还有3条较明显主带,分子量为36 000、26 000和22 900,其他可见带分别为109 800、86 900和62 800。结果表明SDS-PAGE电泳不能检测出E.maxima免疫原性差异株未孢子化卵囊可溶性蛋白的差异。

球虫消毒剂的筛选及氨水对艾美耳球虫卵囊抑杀条件的优化

为了筛选有效的球虫消毒剂,本研究将柔嫩艾美耳球虫卵囊分别与16种常用消毒剂和1种高效抗球虫药物溶液(250mg/L妥曲珠利溶液)混合作用2h然后在2.5%重铬酸钾溶液中孢子化培养,或混合作用4h后接种14日龄雏鸡,根据卵囊孢子化率、孢子化抑制率、每克粪便卵囊数量(oocysts per gram of feces,OPG)、病变计分和血便情况评价消毒剂和抗球虫药物抑杀球虫卵囊效果。结果显示,8%氨水对未孢子化卵囊和孢子化卵囊均表现为100%的抑杀效果;250mg/L妥曲珠利、3%甲醛、4%苯酚、0.5%过氧乙酸、5%NaOH+10%NaCl和5%NaOH对球虫卵囊活性具有一定的抑制作用,孢子化抑制率超过10%,但是对孢子化卵囊抑杀作用不明显;而剩余10种常用消毒剂对球虫卵囊没有明显的抑杀作用。氨水抑杀球虫卵囊条件优化的试验结果显示,1%～8%氨水与未孢子化卵囊作用1h以上,均可100%抑杀球虫卵囊活性。粪便干扰试验结果显示,粪便不影响2%和4%氨水对球虫卵囊的抑杀效果。本研究结果说明常用消毒剂和抗球虫药物不能有效杀灭球虫卵囊的活性,而氨水是一种高效球虫消毒剂。本研究结果可为开发新型高效球虫消毒剂和球虫病控制提供参考。

杀灭柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊的温度及时间确定

为确定鸡球虫病活疫苗生产车间消毒的最佳温度和时间以节约能耗,柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊在不同温度下经不同时间的处理,再接种感染14日龄雏鸡,后代卵囊产量结果显示,60℃处理20 min或80℃处理10 min即可彻底杀灭孢子化卵囊,试验结果为鸡球虫病活疫苗生产车间消毒方式的确定提供了可靠的实验数据和设计基础。

猪囊等孢球虫孢子化与未孢子化卵囊的差异表达蛋白质组学分析

通过比较猪囊等孢球虫孢子化卵囊与未孢子化卵囊的差异表达蛋白质,以期从蛋白质组学角度研究其发育机制,并为此类球虫的发育机制及该病的免疫预防或化学防治找到新的“关键”分子奠定基础。首先建立哺乳仔猪的猪囊等孢球虫感染模型,然后运用iTRAQ技术,结合LC-MS/MS分析差异表达蛋白质,并采用荧光定量PCR验证iTRAQ数据。结果共鉴定出174个蛋白,差异表达蛋白40个,其中38个蛋白上调表达,2个蛋白下调表达,差异蛋白主要涉及代谢、抗生素的生物合成、次生代谢产物的生物合成和糖酵解/糖异生过程等通路。研究结果为阐明猪囊等孢球虫孢子化发育机制以及发现新的生物标志物提供参考。

控制鸡食入孢子化卵囊,可有效预防球虫病

在养鸡行业，鸡球虫病是危害性较大的一种疾病，其造成的经济损失难以估计。到目前为止，虽然人们不断研制出对防治球虫有较好效果的药物，近几年，又出现了球虫弱毒疫苗，但是离彻底控制或较好地控制球虫病发生的目标仍相距甚远。那些建场时间长、采用地面饲养的鸡场，球虫病防治依然令人头痛。

日本鹌鹑艾美耳球虫单卵囊分离及雏鹑扩增研究

为获取大量纯种日本鹌鹑艾美耳球虫（E．uzura），采用饱和食盐水漂浮法收集某场鹌鹑的球虫卵囊，26℃恒温培养至孢子化后，对据形态学鉴定为E．uzura的分离株进行单卵囊分离和雏鹑扩增试验。结果显示，26℃条件下卵囊孢子化时间为14h；单卵囊感染7日龄雏鹑，其潜隐期6d，显露期8～10d；以200个卵囊感染7日龄雏鹑，其潜隐期为5d，显露期为11d。

不同剂量E.tenella感染与雏鸡粪便卵囊排出情况的关系

本试验应用1.0×103、1.0×104和5.0×1043个不同剂量的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊,进行人工感染发病。对雏鸡感染后不同时间的卵囊排出情况进行了观察。结果表明用3个剂量水平分别感染雏鸡时,卵囊排出均集中在第6～12d之间。其中第7d时的卵囊排出量最高,且3个剂量水平中,1.0×103组OPG最高达81.00;1.0×104个/只和5.0×104个剂量组略次之,分别为76.50和68.85;第7d以后各组的卵囊排出量均逐渐减少,到第13d时基本不再向外排卵囊。

柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段虫体抑制性消减文库的构建

为了分离鉴定柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子发育阶段虫体的差异表达基因,分别以柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊和孢子化卵囊为驱动组、子孢子为实验组,或未孢子化卵囊为驱动组、孢子化卵囊为实验组,利用抑制性消减杂交(SSH)技术,构建了2个子孢子cDNA消减文库和1个孢子化卵囊cDNA消减文库。随机从3个cDNA消减文库中分别挑取50个克隆,经PCR鉴定2个子孢子cDNA消减文库的重组率都为96%,孢子化卵囊cDNA消减文库的重组率为98%。从每个文库中随机挑取50个克隆测序,并进行同源性比较分析,结果显示:从孢子化卵囊cDNA消减文库中获得了13个单一有效序列,其中8个EST与已知蛋白同源性很高;从2个子孢子cDNA消减文库中共获得了40个单一有效序列,其中9个EST与已知蛋白同源,其余可能为柔嫩艾美耳球虫的新基因。这些结果为分离柔嫩艾美耳球虫新功能基因和进一步探索防治球虫病的方法提供了理论基础。

堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建及鉴定

构建堆形艾美耳球虫（Eimeria acervulina）孢子化卵囊cDNA表达文库,以筛选其功能性基因.用TRI-ZOL Reagent试剂提取堆形艾美耳球虫总RNA,再用Oligo（dT）12-纤维素柱从总RNA中分离mRNA,以mRNA为模板,RT-PCR法反转录合成cDNA第一链,用LD-PCR法扩增合成双链cDNA,经蛋白酶K消化、SfiⅠ酶切、CHROMA SPIN-400柱分离去除小于400 bp的片段后,将cDNA与已经SfiⅠ酶切的λTriplEx2载体按一定比例连接,经体外包装,建立堆形艾美耳球虫孢子化卵囊的噬菌体表达文库.随后测定文库容量为4.6×10^6pfu/mL,扩增文库的滴度为4.4×10^10pfu/mL,重组率达到98%,插入片段大小为750-1 000 bp,并从扩增文库中扩增出了堆形艾美耳球虫巨噬细胞游走抑制因子基因片段.

柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA表达文库的构建

在无RNase污染的环境下,提取柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）子孢子RNA,进而纯化mRNA,采用Oligo（dT）引物反转录合成cDNA第一链和第二链,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将所产生的cDNA分子定向克隆到具有EcoRⅠ/HindⅢ黏性末端的λSCREEN载体的两臂之间。用Phage Maker extract对以上连接产物进行体外包装,形成完整的噬菌体,并用该噬菌体转染大肠杆菌ER1647,进行文库容量测定和扩增。以扩增文库的DNA为模板,利用已知基因引物克隆E. tenella3-1E基因,并进行测序。结果表明,成功构建了E. tenella孢子化卵囊子孢子的cDNA文库,文库原始库容量约为4×10^6pfu/mL,插入片段约100-3000 bp,扩增得到特定的E. tenella3-1E基因,说明文库质量高、代表性强,为进一步从文库中筛选相关基因提供了有效的工具。