日本血吸虫卵壳蛋白编码基因的扩增和克隆

目的 克隆日本血吸虫卵壳蛋白基因 ,以研究其在诊断和作为候选疫苗分子的作用。方法 设计合成引物 ,以日本血吸虫雌性成虫cDNA第一链为模板 ,用PCR法扩增日本血吸虫卵壳蛋白 (SchistosomajaponicumeggshellproteinSjEP)基因编码序列 ,并克隆入pGEM T质粒载体。结果 PCR法扩增出大小为 62 4bp的单一条带 ,将其克隆入载体获重组质粒 pGEM T SjEP ,经双酶切和以质粒为模板进行PCR扩增 ,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段。结论 日本血吸虫卵壳蛋白的编码基因重组质粒的成功构建 ,为进一步研究提供了条件。

团头鲂卵壳蛋白的分离与纯化

报道了一种从团头鲂卵壳中提取卵壳蛋白的有效方法。该提取液经SDS PAGE电泳鉴定后 ,证明有三条主要的蛋白带 ,其分子量分别为 6 4KDa,5 6KDa和 5 2KDa ,借助于制备型SDS PAGE电泳和电洗脱分离纯化技术 ,获得了三种高纯度的卵壳蛋白。

日本血吸虫卵壳蛋白基因的克隆与表达

目的：在体外高效表达具有生物学和免疫学活性的日本血吸虫卵壳蛋白，探讨其作为抗卵免疫靶抗原的可能性。方法：采用ＰＣＲ技术扩增日本血吸虫卵壳蛋白基因，将其克隆到ｐｃＤＮＡ３质粒，在ＨｅＬａ细胞中高效表达，对表达产物进行鉴定和免疫原性研究。结果：特异扩增日本血吸虫卵壳蛋白基因编码序列（６１８ｂｐ），构建了真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ＥＳＧ，在ＨｅＬａ细胞中高效表达卵壳蛋白，其表达量高达２４．４％，分子量约为２２ｋＤａ，ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析显示，表达蛋白能与感染兔血清及虫卵免疫血清产生较强的免疫反应；此外，表达蛋白还能特异刺激经虫卵免疫后的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠脾细胞增殖，其转化率达４４．５７％。结论：成功地构建重组质粒ｐｃＤＮＡ３／ＥＳＧ，并在ＨｅＬａ细胞中高效表达卵壳蛋白基因。

蚕卵经盐酸浸渍后的卵壳蛋白变化分析

对932品种在卵期发育和幼虫期饲养阶段实施温湿环境调控,让其产下滞育卵和非滞育卵。滞育卵经即时浸酸处理后,用扫描电镜观察卵壳的变化,可见卵壳表面比对照出现较多的裂痕。通过SDS-PAGE电泳技术,比较滞育卵、滞育卵经即时浸酸处理、非滞育卵的卵蛋白变化,发现滞育卵经浸酸处理后,20 ku以下的小分子量蛋白明显减少。利用shotgun技术对此类小分子量蛋白组分进行鉴定分析,发现在滞育卵和非滞育卵中都存在Er B.1、Er B.2、Er B.3、Hc-A和Hc-B卵壳蛋白,在经即时浸酸处理过的滞育卵中却未发现,由此推测蚕卵经浸酸处理后会引起这5种卵壳蛋白的降解。

雌核发育银鲫与两性生殖彩鲫卵壳蛋白组分的比较分析及其受精前后的变化

以雌核发育银鲫和两性生殖彩鲫的成熟卵为材料 ,分离卵壳 ,经处理得到卵壳可溶性蛋白组分。SDS -PAGE梯度凝胶电泳分析在雌核发育银鲫中揭示出3条较明显的差异蛋白带。同时 ,采用相同处理方法对受精前后卵壳蛋白组分进行比较分析后发现 ,这些差异蛋白带在受精后发生了变化 ,其带纹表现为减弱或消失 ,表明这些差异蛋白可能与受精过程相关。

日本血吸虫卵壳蛋白编码基因的扩增及克隆

目的:扩增和克隆日本血吸虫卵壳蛋白编码基因(SjESG),以研究其作为候选疫苗分子和药物靶点的可能性。方法:合成引物,以日本血吸虫雌、雄虫cDNA第一链为模板,RT-PCR扩增日本血吸虫卵壳蛋白编码基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a(+)定向重组,构建原核表达重组质粒,并经限制性核酸内切酶酶切分析和PCR鉴定。结果:从雌虫cDNA中扩增出624bpSjESG基因,原核表达重组质粒pET32a(+)-SjESG经限制性核酸内切酶酶切和PCR均获得624bp的DNA片段。结论:成功构建原核表达重组质粒pET32a(+)-SjESG。

家蚕卵壳蛋白的紫外光谱性质

首次研究了家蚕卵壳蛋白的紫外光潜性质。结果表明,家蚕卵壳蛋白具有两个吸收峰区,除了在270—310nm处由生色氨基酸残基贡献的吸收峰区而外,其在220—260nm处的巨大紫外吸收峰区的物理意义,迄今未见报道。本试验利用DTT和EDTANa_2分别处理该卵壳蛋白后,前者使该紫外吸收峰完全消失,后者使其大部分消失,并皆呈现紫外差光谱峰。这表明双硫键和二价金属桥键是维系家蚕卵壳蛋白高级结构的重要结构力,並表明家蚕卵壳蛋白在220—260nm处的巨大紫外吸收峰是其高级结构的贡献。

日本血吸虫(大陆株)卵壳蛋白编码基因的克隆和序列测定

目的 克隆和鉴定日本血吸虫虫卵卵壳蛋白 (Sj EP)编码基因 ,以寻找血吸虫新的候选疫苗和诊断分子。方法 设计合成引物 ,分别以日本血吸虫雌、雄成虫 c DNA第一链为模板 ,用 PCR法从中扩增出 Sj EP基因编码序列 ,将其克隆入 p GEM-T载体 ,用双酶切、以质粒为模板进行 PCR扩增和测序进行鉴定。结果 PCR法从雌虫 c DNA中扩增出大小为 62 4bp Sj EP基因编码序列 ,重组质粒 p GEM-Sj EP经双酶切、以质粒为模板进行 PCR扩增 ,均可获得一条与 PCR产物一致的 DNA片段 ,序列测定结果表明具有一个长度为 62 4bp的完整开放阅读框 ,与日本血吸虫 (菲律宾株 )虫卵卵壳蛋白核苷酸序列有高度同源性 (99.9% )。结论 本实验成功地克隆了 Sj EP编码基因 ,并进行了序列测定 。

血吸虫卵壳蛋白基因的研究进展

由于虫卵在血吸虫病理学和血吸虫病传播上的重要作用,血吸虫虫卵及血吸虫雌虫产卵机制已成为药理性攻击研究和疫苗研制的重要对象。本文对近年来血吸虫卵壳蛋白基因的研究进行了简要的论述。

卵壳蛋白族的分子生物学研究

以多音天蚕 (Antheraeapolyphemus)和家蚕 (Bombyxmori)为代表 ,综述了蚕卵壳蛋白族的分子生物学研究进展 ,内容包括卵壳蛋白的生物化学、卵壳蛋白基因家族 (结构和功能 )以及卵壳蛋白基因的表达和调节。

血吸虫卵壳蛋白基因的特性

血吸虫卵壳蛋白基因(ESGs)是能被调控的雌虫特异性基因,它不含内含子,具有阶段特异性、性别特异性和雌虫特异性表达的特点,其表达产物——卵壳蛋白可能诱导宿主产生抗卵免疫。本文综述了曼氏血吸虫、埃及血吸虫和日本血吸虫的卵壳蛋白基因的基本结构及其表达产物的特性和生物学潜能的研究进展。

家蚕和蓖麻蚕杂种后代卵壳蛋白氨基酸组成的比较研究

在蚕业应用研究中,应用远缘杂交技术和DNA转化技术是获得优良变异后代的重要手段之一.所以,分析杂种后代的遗传特性及形态结构上的差异,在蚕的遗传育种中应占有重要的位置.我们曾利用高效液相色谱分析了家蚕、柞蚕、蓖麻蚕和天蚕的卵壳蛋白氨基酸组成上的差异.

日本血吸虫卵壳蛋白基因的克隆及真核表达载体的构建

血吸虫卵壳蛋白基因是探讨血吸虫病免疫预防的重要靶标。本研究根据已发表的多个血吸虫卵壳蛋白基因的核苷酸序列,设计合成了特异引物,体外扩增和克隆了编码日本血吸虫中国大陆株卵壳蛋白基因SjESG的cDNA,测序结果表明与已发表的卵壳蛋白基因序列有较高同源性。为进一步研究该基因的功能,将其克隆入pcDNA3中,成功构建了真核表达载体,为SjESGDNA疫苗的研究打下了基础。

鳞头犬牙南极鱼卵壳蛋白的功能初步研究

已有研究表明卵壳蛋白ZPC5(Dissostichus mawsoni zona pellucida c5,Dm ZPC5)在南极鱼卵巢中大量表达,但是其具体功能尚不清楚。为了明确ZPC5是否参与鱼类抗寒过程,研究在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)中过表达南极鱼ZPC5,随之给予CHO细胞一定程度的低温处理,通过统计CHO细胞的存活率,来探讨zpc5在鱼类抗寒过程中的作用。存活率检测结果发现,过表达ZPC5的CHO细胞在0℃处理16 h后,其存活率较对照组显著上升(P<0.001),证明zpc5在低温下可以促进细胞的存活。Western Blot检测结果显示,zpc5能在CHO细胞中高效表达,0℃处理后,CHO细胞内的ZPC5表达量显著上调,证明了低温可以诱导ZPC5的表达。研究结果表明,ZPC5有可能参与南极鱼鱼卵抗寒过程。

日本血吸虫卵壳蛋白基因的筛选及EST序列测定

目的 通过对日本血吸虫(Sj)成虫cDNA文库的核酸杂交筛选，分离出Sj卵壳蛋白相关基因的cDNA克隆，并进一步探讨该基因的结构与功能关系。方法 用地高辛标记的特异性寡核苷酸探针对Sj成虫cDNA文库进行膜原位杂交筛进，挑选出阳性克隆，用通用引物进行PCR扩增，获得cDNA插入片段，采用PCR直接序列测定法，对其部分序列进行测定，而后将EST序列输入GENEBANK进行同源性检索和分析。结果 本实验从Sj cDNA文库筛选到9个不同的阳性克隆，用通用引物扩增出9十分子量大小不同的单一条带，其中两个为已知序列，其余7个为新的EST序列。结论 用寡核苷酸标记探针对Sj文库中进行校酸杂交筛选是寻找特定目的基因的有效方法。

日本血吸虫消减雌性成虫cDNA文库的建立及其特异表达基因的筛选

目的筛选雌性日本血吸虫特异表达基因。方法感染日本血吸虫6周的家兔,用静脉灌注法收集成虫,经核糖核酸固定液固定,分别提取雌、雄成虫总RNA,纯化后获得mRNA,并反转录为cDNA。用抑制性消减杂交技术(SSH)构建雌、雄成虫正向消减(雌虫消减雄虫)及反向消减(雄虫消减雌虫)cDNA文库。用斑点杂交法筛选差异表达基因,挑选目标基因片段(与正向消减探针杂交的信号明显高于与反向消减探针杂交信号的克隆)进行测序、同源性搜索及基因功能预测分析。以日本血吸虫肌动蛋白(actin)基因作内参照,用半定量PCR(semi-quantitative PCR)鉴定目标基因在雌、雄虫体内的表达。结果得到正向消减及反向消减cDNA文库,斑点杂交筛选出50个雌虫特异性表达的克隆,经测序得到42个表达序列标签(EST),其中,有17个基因(占40·5%)与已知日本血吸虫卵壳蛋白基因高度同源;17个基因(占40·5%)与日本血吸虫未知基因高度同源、且有一小片段与卵壳蛋白基因高度同源;有8个基因(占19·0%)与日本血吸虫其他未知基因高度同源。半定量PCR结果,6个基因在雌虫体内的表达水平明显高于雄虫,分别与GenBank的血吸虫卵壳蛋白基因AY222885、AY222895、AB017097、AF519182、M32281及血吸虫其他基因AY813556高度同源。结论构建了雌、雄成虫正向消减及反向消减cDNA文库。用SSH可筛选日本血吸虫雌性特异性表达基因。

SjESG-2A锤头状核酶表达载体构建及其抗日本血吸虫虫卵发育研究

目的设计并合成日本血吸虫中国大陆株卵壳蛋白基因2A(eggshell protein gene 2A,ESG-2A)的特异性锤头状核酶并构建真核表达载体。探讨其在BALB/c小鼠体内的抗日本血吸虫虫卵发育作用。方法运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ),将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,采用双酶切、琼脂糖凝胶电泳及DNA序列测定方法鉴定阳性克隆。以日本血吸虫尾蚴感染BALB/c小鼠,建立动物模型。大量抽提阳性重组子,分别在小鼠感染时、感染后2w、感染后4w,将其经后腿胫前肌免疫BALB/c小鼠,共3次。小鼠感染6w后计数成虫负荷及肝组织虫卵数。ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清IFN-γ和IL-4的水平。结果经酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA3.1(+)的XbaI和EcoR I酶切位点之间,命名为pcRz-ESG-2A。在核酶组,IFN-γ的水平呈上升趋势,IL-4的水平呈先上升后下降;在空载体组和生理盐水组,IFN-γ的水平呈上升趋势,IL-4的水平也呈上升趋势。核酶组免疫BALB/c小鼠能诱生减虫率25.64%和减卵率44.21%。结论成功合成SjESG-2A特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体。核酶在已感染日本血吸虫尾蚴的BALB/c小鼠体内具有抗日本血吸虫虫卵发育的作用。

日本血吸虫卵壳白基因的体外扩增

根据日本血吸虫卵壳蛋白基因的已知序列，借助计算机核酸序列软件分析，设计了一对引物。在5’端引物中引入HindⅢ酶切位点和起始密码子，在3’端引物中引入EcoRⅠ酶切位点和终止密码子，用PCR方法对日本血吸虫虫卵、雌虫、雄虫的基因组DNA进行体外扩增。1％琼脂糖凝胶电泳显示：雌虫和虫卵的基因组DNAPCR产物在618bp处出现特异扩增条带，而雄虫及对照组则无此条带出现。该条带与预期长度相符，并对PCR产物进行纯化和酶切。

家蚕大卵突变基因的性状表达 4.大卵卵壳的表面构造

用干涉相差显微镜比较观察了正常卵与家零星大卵突然变民（Ge）的卵壳表面构造。1、观察Ge卵前极部、后极部、背腹部各区域的特异构造，与正常卵相同，两者间看不邮大的差异。2、观察卵侧面部位也与正常卵一样呈网眼状构造。但各个区域的大小比正常卵小。换言之包卵皮膜分泌卵壳蛋白质的细胞表面积比正常卵小。3、Ge卵包卵皮膜细胞分泌卵壳蛋白质的表面积小，相反，使包卵皮膜细胞数增加而增大卵形。