卵巢上皮癌细胞株OVCAR-3培养相关影响因素分析

目的探讨卵巢上皮癌细胞OVCAR-3培养的影响因素,提高培养的成功率。方法按培养条件分为:未滤菌加抗菌素组、滤菌加抗菌素组、滤菌不加抗菌素组及改良复苏组,取对数生长期的细胞裸鼠皮下种植,观察成瘤率并行组织学检查。结果未滤菌加抗菌素组,复苏培养5次,全部失败;滤菌加抗菌素组,复苏培养10次,全部成功;滤菌不加抗菌素组,复苏培养10次,失败4次,成功率60%;改良复苏组:复苏培养10次,全部成功。种植后2周出现瘤体,各组成瘤率100%,各组肿瘤组织学检查未见明显差异。结论无菌操作是OVCAR-3最重要的影响因素,滤菌及加用抗菌素是关键步骤。

红花多糖对人卵巢上皮癌细胞增殖、转移的影响及机制探讨

目的探讨红花多糖(SPS)对人卵巢上皮癌细胞增殖和转移的影响。方法体外培养人卵巢上皮癌细胞A2780,加入含不同质量浓度SPS(0,0.04,0.08,0.16,0.32,0.64,1.28g/L)的培养液,分别培养24h和48h,采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测SPS对细胞转移的影响;用划痕实验法和Transwell法检测0.16,0.32,0.64g/L浓度的SPS作用48h后对卵巢上皮癌细胞转移能力的影响;采用蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测β-catein蛋白的表达。结果卵巢上皮癌细胞的生存率随SPS浓度和作用时间的增加而降低,SPS作用48h后卵巢上皮癌细胞的转移能力随SPS浓度的增加而减弱,β-catein蛋白表达降低,并具有剂量依赖性。结论 SPS可能通过抑制β-catein蛋白的表达,抑制卵巢上皮细胞癌的转移能力,进而起到抗肿瘤作用。

MicroRNA-150对上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡和侵袭转移能力的影响

目的研究micro RNA-150(mi R-150)在人上皮性卵巢癌细胞中的表达情况,及其对人上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡和侵袭转移能力的影响。方法通过荧光实时定量PCR(q RT-PCR)检测各处理组细胞中的mi R-150表达水平;利用MTT法、流式细胞技术、Transwell法探究mi R-150的表达对上皮性卵巢癌细胞增殖、凋亡及侵袭转移能力的影响。结果与正常卵巢上皮细胞(T29)相比,上皮性卵巢癌细胞(A2780和OVCAR3)中mi R-150表达显著降低(P<0.01);转染mi R-150mimic后,A2780和OVCAR3细胞中mi R-150水平明显升高(P<0.01);MTT试验显示,转染培养三天后,mi R-150 mimic组细胞OD值(A2780:1.12±0.03;OVCAR3:1.91±0.03)较Blank组(A2780:2.35±0.09;OVCAR3:2.63±0.07)及mi R-150 NC组(A2780:2.18±0.07;OVCAR3:2.43±0.11)明显降低(P<0.01);细胞凋亡检测显示:mi R-150 mimic组凋亡率(A2780:16.10±0.58%;OVCAR3:15.16±1.30%)较Blank组(A2780:10.07±0.66%;OVCAR3:3.81±0.24%)及mi R-150 NC组(A2780:10.36±1.08%;OVCAR3:4.89±0.07%)明显升高(P<0.01);Transwell试验显示:mi R-150 mimic组穿膜细胞数(A2780:38.67±2.03;OVCAR3:28.67±2.03)较Blank组(A2780:76.30±7.45;OVCAR3:55.67±3.18)及mi R-150 NC组(A2780:74.33±5.78;OVCAR3:56.33±3.84)明显减少(P<0.01)。结论 mi R-150在上皮性卵巢癌细胞中表达降低,可能是上皮性卵巢癌增殖、侵袭转移的机制之一;上调mi R-150的表达可以抑制上皮性卵巢癌细胞增殖、促进细胞凋亡,并且降低上皮性卵巢癌细胞侵袭转移能力。

3-甲基腺嘌呤对低氧状态下上皮性卵巢癌细胞自噬、迁移和侵袭的影响

目的·检测3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对低氧状态下上皮性卵巢癌细胞(epithelial ovarian carcinoma,EOC)自噬、迁移和侵袭的影响。方法·不同浓度的3-MA处理低氧环境下EOC细胞,Western blotting检测自噬相关蛋白LC3的表达,透射电子显微镜观察自噬体的生成,噻唑蓝比色法、黏附试验、Transwell迁移试验和Matrigel侵袭试验分别测定EOC细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭能力。结果·3-MA可以抑制低氧环境诱导的LC3-Ⅱ表达增加以及自噬体生成。低氧环境下,5.00 mmol/L的3-MA作用24 h可显著降低EOC细胞存活率(P=0.000);2.50 mmol/L的3-MA作用6 h后,细胞的黏附能力显著降低(P=0.007);1.25 mmol/L和2.50 mmol/L的3-MA均可抑制低氧环境下EOC细胞的迁移和侵袭能力(均P<0.01)。结论·3-MA在抑制低氧状态下EOC细胞自噬的同时,具有抗细胞迁移和侵袭的作用。

米非司酮对人卵巢上皮性癌细胞株的增殖抑制作用

目的 探讨米非司酮对人卵巢上皮性癌细胞株的生长抑制作用。方法 采用MTT测定 ,观察不同浓度米非司酮对HO8910 细胞的生长抑制作用 ,通过免疫组化染色 ,检测用药后细胞核增殖抗原Ki 67表达的变化。结果 3个浓度的米非司酮对上述细胞均有抑制作用 ,以 2 0 μmol/L浓度抑制最明显 ,抑制率达 50 .2 8% ;5μmol/L米非司酮可使HO8910 细胞Ki 67抗原表达显著减少 ,细胞增殖受到明显抑制。结论 米非司酮对人卵巢上皮性癌细胞株具有明显抑制作用 ,且通过降低核增殖抗原Ki

全反式维A酸对卵巢上皮性腺癌细胞株COC2中RARa基因甲基化影响的研究

目的:全反式维A酸是一种经典的诱导肿瘤细胞分化的药物,但关于其对肿瘤细胞的异常甲基化的影响,国内研究仍很少,文中通过观察全反式维A酸(ATRA)对卵巢上皮性腺癌细胞株COC2中RARa基因启动子甲基化位点的影响,及其对RARa基因mRNA表达的影响,探讨ATRA对RARa基因启动子区异常甲基化可能的作用。方法:用不同浓度及作用时间的ATRA体外干预COC2细胞,甲基化特异性PCR及基因测序法检测用药前后COC2细胞中RARa启动子区甲基化状态的改变。RT-PCR法检测各组RARa基因mRNA表达的改变。结果:COC2细胞中存在RARa基因启动子区异常甲基化;不同浓度ATRA处理后,RARa启动子的异常甲基化位点出现部分逆转,并在一定范围内表现出浓度及时间依赖性,RARa基因的mRNA表达也同样表现为增高趋势。结论:COC2细胞中存在RARa基因启动子区异常高甲基化;ATRA可以部分逆转RARa启动子区的异常甲基化位点并增加RARamRNA的表达。

上皮性卵巢癌细胞增殖状态与肿瘤血管生成关系的研究

目的 探讨上皮性卵巢癌不同分级、不同临床分期细胞增殖状态及肿瘤微血管密度 (MVD)以及两者之间的关系。方法 应用增殖细胞核抗原 (PCNA) ,采用SABC法 ,检测细胞增殖状态并计算细胞增殖指数 (PI)。采用FⅧ相关抗原 ,应用SABC法 ,检测上皮性卵巢癌肿瘤微血管密度。应用Spear man等级相关法检测PI与MVD的相关性。结果 (1) 4 5例上皮性卵巢癌中PI均值为 35 .7± 10 .9,MVD均值为 31.7± 11.2 (40 0倍镜下 )。不同临床分期、组织分级的PI无显著性差异 (P >0 .0 5 )。MVD在不同的卵巢癌临床分期中的差异有显著性意义 (P <0 .0 5 ) ,临床Ⅲ～Ⅳ期肿瘤MVD高于临床Ⅰ～Ⅱ期 (P <0 .0 5 )。 (2 )上皮性卵巢癌中PI与MVD无明显相关 (P >0 .0 5 )。结论 肿瘤血管生成是上皮性卵巢癌发展的伴随条件 ,随着卵巢癌的进展 ,肿瘤血管生成是增加的。上皮性卵巢癌中细胞增殖状态与肿瘤血管生成无明显相关。肿瘤血管生成的机制与肿瘤细胞增殖的机理可能不同。

KiSS-1基因对卵巢癌细胞HO8910生物学行为影响的实验研究

目的探讨肿瘤转移抑制基因KiSS1对卵巢癌细胞株HO8910生物学行为的影响。方法含有人KiSS1基因全长cDNA的重组真核表达载体pcDNA3KiSS-1经酶切和测序鉴定正确后,转染卵巢上皮癌细胞株HO8910,观察其KiSS1mRNA表达、细胞生长及增殖能力和细胞侵袭力的变化。结果pcDNA3KiSS1成功转染HO8910细胞,KiSS1mRNA表达阳性,而亲本HO8910细胞为阴性。转染目的基因后细胞生长曲线、软琼脂克隆形成率等与未转染之细胞无显著性差异(P>0.05),但细胞侵袭能力明显下降(P<0.01),穿透Matrigel膜细胞数较未转染组明显减少(P<0.01)。结论KiSS1基因对卵巢上皮癌细胞HO8910的生长、增殖能力无影响,但可抑制其侵袭能力。

人上皮性卵巢癌细胞系SKOV3-luc裸鼠皮下及原位移植瘤模型的建立与研究

目的:建立整体可视化人卵巢癌皮下和原位移植瘤模型,用于实时观察和分析人卵巢癌移植瘤发展和转移的规律,并比较两者的成瘤情况及生物学特性。方法:使用带有荧光素酶报告基因(Luciferase)的人上皮性卵巢癌细胞系SKOV3-luc分别接种于裸鼠右侧腋窝皮下和左侧卵巢内,建立人上皮性卵巢癌裸鼠皮下和原位移植瘤模型。实时观察卵巢癌细胞SKOV3-luc在裸鼠皮下和原位的生长情况,并切取肿瘤组织,应用病理组织学方法对裸鼠皮下移植瘤和原位移植瘤进行检测和评价。结果:人卵巢癌细胞系SKOV3-luc裸鼠皮下和原位移植瘤模型建立的成功率均较高。裸鼠皮下和左侧卵巢接种肿瘤细胞后,可通过活体成像实时观察肿瘤的生长情况,并且行定量分析肿瘤形成时间等。皮下移植瘤(皮下组)成瘤率为100%,左侧卵巢原位移植瘤(原位组)成功率为100%。注射后第7天,皮下组的肿瘤总荧光强度比值为(3.38±2.50)(Fold),原位组为(1.43±1.32)(Fold);第14天,皮下组为(15.73±11.70)(Fold),原位组为(6.44±7.26)(Fold),皮下组第7天和第14天的肿瘤总荧光强度比值均大于原位组(P<0.05)。结论:人上皮性卵巢癌裸鼠皮下移植瘤和卵巢原位移植瘤建模成功率高,并能很好地反应肿瘤的生物学行为,实时荧光成像便于观察肿瘤体内生长情况,为研究卵巢癌发展和转移提供了可靠的观察模型。

Snail蛋白对E-钙黏蛋白表达的抑制在上皮性卵巢癌细胞侵袭及淋巴结转移中的作用

目的:探讨Snail蛋白对E-钙黏蛋白(E-cad)表达的抑制在上皮性卵巢癌细胞侵袭及淋巴结转移中的作用。方法:选择人卵巢癌细胞株C13,将Snail/siRNA、Snail/smRNA分别转入C13细胞,以PBS作为空白对照组,检测E-cad蛋白表达情况,采用Transwell上室进行细胞侵袭性及淋巴结转移实验分析。结果:C13细胞空白对照组、Snail/smRNA组、Snail/siRNA组,12 h穿膜细胞数分别为98.24±7.92、90.93±8.38和21.48±4.85,Snail/siRNA组与另两组相比有显著性差异(P<0.05);Snail/siRNA组的转移细胞与另两组相比也有显著性差异(P<0.05)。相对于Snail/smRNA组,Snail/siRNA组细胞E-cad的蛋白水平降低,两组差异有统计学意义(P<0.05),而空白对照组则没有明显变化(P>0.05)。结论:Snail蛋白对E-cad表达的抑制能抑制上皮性卵巢癌细胞的侵袭及转移,能够在分析卵巢癌转移分子机制时给予理论支持,为靶向逆转的研究提供了可供参考的靶点。

PDGF-C促进体外培养人卵巢癌细胞系A2780和SKOV3的增殖和迁移

目的观察血小板衍生生长因子-C(PDGF-C)对体外培养的卵巢上皮癌细胞系A2780和人浆液性卵巢癌细胞系SKOV3的影响。方法采用培养的人类上皮性卵巢癌细胞系A2780和SKOV3,应用CCK8检测法评价细胞的增殖情况,流式细胞术检测细胞周期;利用Transwell细胞迁移实验、细胞划痕实验测定细胞迁移能力。结果PDGF-C能明显刺激A2780和SKOV3增殖,增加两种细胞S期细胞的比例,对SKOV3的促增殖作用在20μg/L达高峰,A2780的促增殖作用在30μg/L达高峰。同时,PDGF-C促进A2780和SKOV3的迁移能力。结论 PDGF-C可促进培养的A2780和SKOV3的增殖与迁移能力。

FXR1基因过表达对卵巢癌细胞生物学行为影响的初步研究

背景与目的:前期研究显示,FXR1基因是从卵巢上皮癌cDNA文库中筛选到的相关抗原基因,FXR1抗原蛋白的自身抗体可用于早期卵巢癌的诊断。本研究的目的是分析上调上皮性卵巢癌相关抗原基因FXR1表达对卵巢癌细胞系HO8910生物学行为的影响。方法:采用半定量RT-PCR法检测在不同卵巢组织中,FXR1 mRNA的表达,并分析其与临床病理的关系。RT-PCR扩增FXR1 CDS,构建FXR1真核表达载体,脂质体介导下转染HO8910细胞,经G418筛选获得稳定转染株,检测转染后细胞相应生物学行为。结果:FXR1 mRNA在卵巢癌组织中的相对表达水平比卵巢良性肿瘤组织及正常卵巢组织均增高(P<0.05);FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期和高分化癌组织中FXR1 mRNA相对表达水平低于Ⅲ期和中-低分化组织(P<0.05);成功构建了FXR1基因的真核表达载体,并稳定转染了HO8910细胞。生长曲线显示上调FXR1基因表达可促进细胞的生长;克隆形成实验显示上调FXR1基因表达可促进细胞增殖。基质黏附实验显示,上调FXR1基因表达可加强细胞对基质的黏附能力,流式细胞周期检测亦发现与对照(80%)相比,转染FXR1基因后G1期细胞(67.1%)比例明显减少,这说明转染FXR1后细胞的增殖更旺盛。同时发现FXR1对细胞侵袭、迁移的能力无明显影响。结论:上调FXR1基因表达可能有促进卵巢癌细胞的生长、增殖、加强细胞对基质黏附能力的作用。

肿瘤转移抑制基因KAI1/CD82在顺铂作用下的卵巢癌细胞中表达的变化

目的研究顺铂(cDDP)作用下人卵巢上皮性癌细胞株3AO中肿瘤转移抑制基因KAI1/CD82的表达的变化,初步探讨其作用机制。方法采用倒置显微镜观察cDDP作用后3AO细胞形态学的变化;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察cDDP对细胞增殖的影响;运用免疫细胞化学方法检测不同浓度cDDP(1、3、9 mg/L3个浓度组)作用的3AO细胞株中KAI1/CD82表达情况,并与细胞对照组(未经药物处理)进行比较。结果cDDP作用后细胞体积缩小、细胞内颗粒增多,细胞核固缩、深染,细胞凋亡;cDDP对3AO细胞的生长抑制作用呈明显的剂量依赖关系;cDDP作用后卵巢癌细胞中KAI1/CD82基因的表达较对照组明显增强。结论cDDP不仅能增加对卵巢癌细胞的生长抑制率,而且能上调卵巢癌细胞中肿瘤转移抑制基因KAI1/CD82的表达,为临床上药物抑制肿瘤转移的深入研究提供了有利的实验依据。

缺氧卵巢癌细胞分化过程中LSD1表达的改变

目的通过体外实验研究缺氧状态卵巢上皮性癌细胞分化为内皮细胞中的LSD1的表达情况。方法常氧和缺氧培养OVCAR-3细胞,显微镜观察OVCAR-3细胞拟态血管形态。应用Western印迹检测经处理后OVCAR-3细胞株中LSD1的表达变化,并检测组蛋白的H3K4(2m)甲基化水平。结果在三维培养卵巢上皮性癌细胞系OVCAR-3时缺氧可诱导拟态血管的形成。Westem印迹检测出变化,缺氧条件下相对常氧条件下的LSD1表达量增加(2.91±0.2),且差异有统计学意义(P<0.05),组蛋白H3K4(2m)甲基化水平下降明显(0.22±0.03),且差异有统计学意义(P<0.05)。结论缺氧可诱导上皮性卵巢癌OVCAR3细胞LSD1表达上升,同时在体外三维立体培养中形成拟态血管。

全反式维A酸对卵巢上皮性腺癌侵袭潜能的影响

目的:通过观察全反式维A酸(ATRA)对卵巢上皮性腺癌细胞株COC2细胞中上皮性钙黏附素(E-cadherin)、乙酰肝素酶和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的作用,探讨ATRA对卵巢上皮性腺癌侵袭潜能的影响。方法:利用流式细胞仪检测经不同浓度的ATRA干预前后的COC2细胞中E-cadherin、乙酰肝素酶和VEGF的蛋白含量。结果:COC2细胞经ATRA干预后,细胞表面E-cadherin蛋白含量明显增多,细胞内VEGF蛋白以及细胞表面乙酰肝素酶的含量明显降低,呈剂量依赖性。各加药组与对照组比较,差异有统计学意义。结论:ATRA不仅能够增加COC2细胞中E-cadherin蛋白的含量,增强肿瘤细胞间黏附能力;而且能够降低乙酰肝素酶和VEGF蛋白的表达,抑制肿瘤细胞对细胞外基质和基底膜的破坏,并具有抗血管新生作用,从而降低卵巢上皮性腺癌细胞的侵袭转移能力。

紫杉醇联合LY294002对卵巢癌3AO细胞CyclinD1表达的影响

目的通过对人上皮性卵巢癌细胞株3AO在紫杉醇及紫杉醇联合2-(4-吗琳基)-8-苯基-4氢-1-苯并毗喃-4-酮(LY294002)作用后细胞周期蛋白D1(CyclinD1)的表达及细胞周期变化和细胞凋亡的分析,为卵巢癌化疗寻求一种新的高效辅助治疗手段及一种高效的生物学标志物。方法采用RT-PCR技术,检测3AO在空白组、单纯紫杉醇组、和LY294002预处理24h后紫杉醇(紫杉醇+LY294002)作用组的CyclinD1的表达。并采用流式细胞术分析3组CyclinD1的表达水平及细胞凋亡及细胞周期的变化。结果 3AO在空白组、紫杉醇组和紫杉醇联合LY294002组CyclinD1mRNA表达水平不同,呈逐渐减弱趋势。空白组、紫杉醇组和紫杉醇联合LY294002组细胞周期各时相、细胞凋亡率及细胞增殖指数PI(S+G2/M)值不同,细胞凋亡率逐渐增加,细胞增殖指数PI值逐渐下降,细胞生长受到抑制,CyclinD1表达水平逐渐下降。结论卵巢癌3AO中存在CyclinD1基因的异常扩增及过表达,CyclinD1的表达水平与细胞增殖呈正相关。紫杉醇联合LY294002能促进3AO凋亡,LY294002对紫杉醇诱导3AO凋亡具有协同效果。

外泌体miR-29对上皮性卵巢癌细胞的迁移、侵袭及血管生成能力的影响

目的探究外泌体微小RNA29(miR-29)对上皮性卵巢癌(EOC)细胞的迁移、侵袭及血管生成能力的影响,及其作用机制。方法体外培养EOC细胞系SK-OV-3细胞,并分为空白组(不做任何处理)、对照组(加入空白病毒外泌体)和实验组(加入miR-29高表达的病毒外泌体)。用实时荧光定量聚合酶链反应检测细胞miR-29的表达情况,分别用CCK-8、划痕实验及Transwell实验检测各组细胞的增殖、迁移及侵袭能力,用小管生成实验检测细胞血管生成能力。结果空白组、对照组和实验组的miR-29相对表达量分别为0.52±0.06、0.54±0.05和1.35±0.15,小管形成数分别为(11.18±1.20)、(11.26±1.25)和(5.18±0.61)个,细胞增殖抑制率分别为0.00、(0.05±0.01)%和(12.75±0.15)%,划痕愈合率分别为(26.08±2.94)%、(25.46±3.06)%和(18.81±1.86)%,细胞侵袭细胞数分别为(96.18±9.81)、(95.61±9.98)和(42.38±4.36)个。空白组的上述指标与对照组比较,差异均无统计学意义(均P>0.05);实验组的上述指标与空白组和对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论外泌体miR-29的高度表达能够抑制EOC细胞增殖、迁移及侵袭能力,降低血管生成能力。

转染miRNA27a抑制物对卵巢癌耐药细胞系顺铂敏感性的研究

目的研究下调miRNA27a对卵巢癌细胞系skov3/DDP顺铂耐药性的影响。方法培养卵巢癌细胞系skov3,使用顺铂诱导,建立卵巢癌顺铂耐药细胞系skov3/DD,MTT法检测细胞耐药系数,Real-time RT-PCR检测miRNA27a在skov3/DDP及skov3中的表达情况,将miRNA27a抑制物转入skov3/DDP,Real-time RT-PCR检测MDR1基因的转录水平,流式细胞术检测细胞凋亡,Western Blot检测P-gp蛋白表达水平。结果与skov3相比,skov3/DDP耐药系数为5.08;miRNA27a在skov3/DDP中的表达明显上升;转染miRNA27a抑制物之后,与阴性对照相比,skov3/DDP中的MDR1的转录水平无明显差异(P>0.05);但与SKOV3相比,SKOV3/DDP中p-gp蛋白的表达水平明显升高,约为SKOV3的1.5倍(P<0.05),而转染了miRNA27a抑制物之后,SKOV3/DDP中P-gp的蛋白表达水平明显降低,与SKOV3相比,表达量减少了32.7%(P<0.05)。结论 miRNA27a在skov3/DDP中高表达,导致了skov3/DDP对顺铂产生了明显的耐药性,其机制主要是通过在P-gp的翻译水平诱导其耐药性的产生。

过氧化物酶体增殖物活化受体γ共激活因子1α对人卵巢癌细胞的凋亡作用

目的研究过氧化物酶体增殖物活化受体γ共激活因子1α(PGC-1α)对人卵巢上皮癌细胞凋亡的调控作用。方法选用人卵巢癌细胞株 H08910进行体外培养,实验组设3组的对照组加入绿色荧光蛋白(GFP)基因的腺病毒载体,Ad-GFP组(绿色荧光感染),Ad-PCG-1α组(PCG-1α绿色荧光感染)采用 Hoeches 染色法检测细胞凋亡,并用流式细胞仪测定凋亡率。定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞内凋亡相关基因 Bax 和 Bcl-2 mRNA 的表达。选用中国仓鼠正常卵巢细胞(CHO)作为对照,同样方法过表达 PGC-1α检测凋亡。结果在人卵巢癌细胞 HO8910中过表达PGC-1α能明显诱导细胞凋亡,光学显微镜观察到细胞凋亡,流式细胞仪测定凋亡率达58.9%。过表达 PGC-1α使 HO8910细胞内的 Bax 表达上调1.5倍,而 Bcl-2表达下降了69%。而在正常仓鼠卵巢细胞中过表达 PGC-1α,细胞未见明显的凋亡发生。结论 PGC-1α能显著诱导人卵巢痛细胞发生凋亡,促凋亡基因 Bax 表达上调和抗调亡基因 Bcl-2表达下降可能是诱发细胞凋亡的机理之一。PGC-1α具有特异性促肿瘤细胞凋亡的作用。