猪卵巢组织玻璃化冷冻保存初步研究

为了建立一种有效的卵巢组织玻璃化冷冻方法,试验采用乙二醇(EG)+二甲基亚矾(DMSO)作为玻璃化冷冻保护剂,将猪卵巢组织经过不同浓度的平衡液中处理后进行玻璃化冷冻保存。结果表明,经过两步平衡冷冻组卵巢组织中的卵泡形态结构基本正常;提取卵巢组织细胞DNA进行琼脂糖凝胶电泳,检测玻璃化冷冻卵巢组织细胞DNA损伤,各实验组与对照组的结果无显著差异。显示采用EG+DMSO作为玻璃化冷冻保护剂、两步平衡玻璃化冷冻方法可用于猪卵巢组织的冷冻保存,该方法不造成卵巢组织细胞DNA的损伤。

卵巢组织玻璃化冷冻保存和移植的研究进展

背景:卵巢组织玻璃化冷冻技术作为一种快速、简便、经济的冷冻方式被逐渐应用于卵巢组织的保存。目的:综述国内外关于卵巢组织玻璃化冷冻保存及移植的研究进展。方法:由第一作者检索1995/2011PubMed数据库及清华同方数据库有关卵巢组织玻璃化冷冻保存以及卵巢组织移植技术等方面的文献。结果与结论:玻璃化冷冻是一个超高速的冷冻过程,形成高黏度的"玻璃样凝固状态",可以避免由于冰晶形成所造成的细胞损伤。但至今玻璃化冷冻仍缺乏统一的标准化程序。影响卵巢组织玻璃化冷冻保存效果的主要因素有卵巢组织块的大小、冷冻保护剂的种类、渗透平衡的时间和温度、冷冻载体等。随着低温生物学的发展和卵巢组织冷冻保存效果的提高,卵巢组织的移植已经具备了一定的临床应用可行性。到目前为止,全世界已有一系列关于冻存卵巢组织移植后成功妊娠及分娩的报道,移植成功的关键在于减少缺血再灌注损伤和促进新生血管的形成。

新生小鼠卵巢组织玻璃化冷冻保存与异体异位移植研究

开展小鼠新生胎儿卵巢组织冷冻保存与移植研究,为建立家畜卵巢组织冷冻保存与移植技术奠定基础。采用微滴法玻璃化冻存方法处理卵巢,卵巢复苏后移植到昆明系雄性小鼠受体肾囊下,19只雄性受体鼠接受了卵巢移植,每侧肾囊移植2枚,卵巢共移植1日龄小鼠卵巢38个。饲喂28 d有效回收移植卵巢的受体鼠为17只,受体总有效率分别为89.4%;有效回收移植卵巢30个,卵巢总回收率为78.9%。结果表明,小鼠早期卵巢经过冷冻、解冻并异体异位移植后,其原始卵泡能够重新启动生长发育。

卵巢组织玻璃化冷冻保存的研究进展

就目前卵巢组织玻璃化冷冻保存的发展状况及影响卵巢冻融成功的因素等几个方面进行综述,并对卵巢组织冷冻保存所存在的问题及今后研究方向提出了自己的看法。

抗氧化剂在卵巢组织玻璃化冷冻保存中的研究进展

2020年,中国新发癌症患者457万,而目前对于癌症患者常用的治疗手段会导致女性卵巢早衰,具估计中国每年需要生育力保护或生育力保存的女性患者超过200万^([1])。过去的几十年里生育力保存技术取得了巨大的发展,给患者带来更多选择和希望。生育力保存新技术——卵巢组织冷冻,不受年龄和婚姻状况的限制,还可以储存大量的对冷冻保存具有更好耐受性的原始卵泡,这为未来可受精卵母细胞的来源提供了可能。因此在女性生育力保存方面,卵巢组织冷冻更具有优势。

甘氨酸对小鼠完整卵巢组织玻璃化冷冻的影响

本实验旨在探究与传统冷冻液相比,昆明小鼠完整卵巢组织玻璃化冷冻液中添加甘氨酸对组织内卵母细胞解冻后细胞形态、组织内凋亡基因表达的影响。选用15只7~8周龄雌性昆明小鼠,取卵巢分为3组,即冷冻液组、血清+冷冻液组、甘氨酸+冷冻液组(在冷冻液、解冻液中添加甘氨酸使其终浓度为1 mmol/L),每组10个卵巢。对解冻后卵巢组织分别体外恢复3 h以及体外培养4 d,采用western blot法检测各组凋亡蛋白(cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax)表达情况以及荧光定量PCR检测凋亡相关mRNA(GAPDH、Bcl-2、Bax)的表达情况。结果表明:甘氨酸+冷冻液组解冻体外恢复3 h后卵母细胞形态正常率高于冷冻液组(P<0.05),也高于血清+冷冻液组但差异不显著;甘氨酸+冷冻液组的cleaved-caspase 3表达情况低于其他2组(P<0.05),Bcl-2/Bax凋亡蛋白表达水平高于其他2组(P<0.05);甘氨酸+冷冻液组GAPDH基因相对表达量高于其他2组(P<0.05)。甘氨酸+冷冻液组Bcl-2/Bax基因比值高于血清+冷冻液组、冷冻液组(P<0.05)。结果表明,添加1 mmol/L甘氨酸可以保护解冻后卵母细胞的形态结构以及抑制卵巢组织内细胞凋亡水平。

以细胞筛为载体的玻璃化冷冻和慢速程序化冷冻保存人卵巢组织的效果比较

目的比较以细胞筛为载体的玻璃化冷冻与慢速程序化冷冻用于人卵巢组织冷冻的效果。方法人卵巢组织取皮质切块后,随机分为3组:新鲜组织对照组(F组)、慢速程序化冷冻组(S组)及以细胞筛为载体玻璃化冷冻组(V组)。卵巢组织冷冻复苏后,固定切片后行苏木素-伊红染色,观察卵泡形态;使用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术,观察卵泡凋亡情况;部分卵巢组织体外培养,隔日采集培养液后检测雌二醇(E2)浓度。比较三组卵泡正常形态率、卵泡凋亡率及E2浓度。结果与F组原始卵泡正常形态率(91.1%)相比,V组原始卵泡正常形态率(88.1%)无显著差异(P>0.05),而S组原始卵泡正常形态率(79.6%)显著下降(P<0.001);V组初级卵泡正常形态率(74.2%)与S组(73.6%)相似,但两组均低于F组(89.0%)(P<0.05);凋亡检测中,3组凋亡率无显著差异(P>0.05);体外培养2周,各组E2浓度持续上升,F组E2浓度显著高于S组、V组(P<0.001),而S组与V组E2浓度无显著差异(P>0.05)。结论以细胞筛为载体的玻璃化冷冻能较好地保存人卵巢组织,复苏后组织体外培养后,还可持续分泌E2。

新型玻璃化冷冻法在人卵巢组织深低温保存的应用

目的:分析新型玻璃化冷冻方法(NIV)与其他冷冻方法在人卵巢组织冷冻中的保存效果。方法:对10例患者的卵巢组织皮质片进行NIV法(NIV组)与程序化慢速冷冻法(慢速冷冻组)、滴入法玻璃化冷冻法(滴入法组)深低温保存,并与未行冷冻的新鲜卵巢组织(新鲜组)进行凋亡检测、组织体外培养和形态学分析、培养液中乳酸脱氢酶(LDH)浓度测定,并进行比较。结果:①新鲜组中正常始基卵泡百分率高于各冷冻组(P<0.01)。正常形态始基卵泡数目在各冷冻组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。②各组卵巢皮质中始基卵泡凋亡发生率:各冷冻组均较新鲜组明显增加(P<0.01);各冷冻组间两两比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。卵巢间质细胞凋亡发生率:各冷冻组较新鲜组明显增加(P<0.01);在各冷冻组间比较,NIV组间质细胞凋亡率较慢速冷冻组和滴入法组明显降低(P<0.05)。③各冷冻组LDH浓度均高于新鲜组(P<0.01)。在各冷冻组间比较,NIV组LDH浓度低于慢速冷冻组和滴入法组(P<0.01)。结论:NIV法较程序化慢速冷冻和滴入法玻璃化冷冻法能更好地保存卵泡周围的间质细胞。

玻璃化冷冻保存对小鼠卵巢组织的影响

目的探讨玻璃化冷冻保存对小鼠卵巢组织内卵泡形态及卵巢组织激素分泌功能的影响。方法将23只4周龄ICR雌鼠随机分为新鲜卵巢组、去势组和玻璃化冷冻组,应用乙二醇(EG)和二甲基亚砜(DMSO)玻璃化冷冻小鼠卵巢组织。冷冻前后取部分小鼠卵巢组织行组织学观察;同时将部分新鲜和复苏组织自体移植入小鼠肾被膜下。移植术后5 d开始观察小鼠的动情周期,术后30d测定小鼠血清雌激素浓度。结果冻融卵巢组织内存活的原始卵泡和初级卵泡与新鲜组织无显著差异(P>0.05);而次级卵泡的存活率显著下降(P<0.01)。移植术后玻璃化冷冻组和新鲜卵巢组小鼠均出现动情周期,两组动情周期出现时间无明显差异(P>0.05)。移植术后第30天两组小鼠血清雌激素浓度无显著差异(P>0.05)。结论玻璃化冷冻法可以较好地保存小鼠卵巢组织内的原始卵泡和初级卵泡,且不影响卵巢组织的激素分泌。

成人卵巢组织玻璃化冷冻保存的实验研究

目的探讨玻璃化法冷冻保存对成人卵巢组织的影响。方法采集21例成人卵巢组织,随机分成三组:新鲜对照组、玻璃化冷冻组、程序冷冻组。新鲜的和冻融后的卵巢皮质分别进行光学显微镜观察和原位末端转移酶标记(TUNEL)实验。结果二个冷冻组的异常始基卵泡及初级卵泡比率差别无统计学意义(P>0.05),但均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。冷冻组与对照组的卵泡凋亡率差别无统计学意义(P>0.05)。结论玻璃化冷冻是人类卵巢组织较适宜的冷冻保存方法。

应用自研载体的玻璃化冷冻与慢速程序化冷冻保存羊卵巢组织的效果比较

目的自研冷冻载体用于羊卵巢组织的玻璃化冷冻,探讨自研载体对羊卵巢组织的冷冻保存效果。方法将获取的32只羊卵巢通过简单随机抽样方式分配到新鲜组、程序化冷冻组、自研载体I玻璃化冷冻组及自研载体Ⅱ玻璃化冷冻组,观察各组卵巢组织形态、增殖与凋亡及培养后雌激素分泌水平。结果冷冻复苏后程序化冷冻组、自研载体I玻璃化冷冻组及自研载体Ⅱ玻璃化冷冻组原始卵泡形态正常率分别为74.2%、72.8%、72.3%,低于新鲜组83.7%(χ^(2)=13.079,P=0.004),程序化冷冻组初级卵泡正常形态率低于新鲜组(χ^(2)=12.486,P=0.000),2个玻璃化冷冻组初级卵泡正常形态率与新鲜组比较差异无统计学意义(P=1.000,P=0.972);各组之间激素水平及增殖细胞核抗原阳性表达率差异无统计学意义(F=0.363,P=0.780;χ^(2)=0.359,P=0.949);冷冻复苏各组细胞凋亡数目均明显高于新鲜组(F=37.584,P=0.000),程序化冷冻组细胞凋亡数目明显高于自研载体I玻璃化冷冻组和自研载体Ⅱ玻璃化冷冻组(F=18.992,P=0.000)。结论应用自研载体的玻璃化冷冻与慢速程序化冷冻相比能更好地保存大块羊卵巢组织的细胞活性。

小鼠卵巢组织玻璃化冷冻保存的研究

为了探索小鼠卵巢组织玻璃化冷冻保存的有效方法,以5周龄昆明小白鼠的卵巢为材料,分别采用不同的冷冻保护剂、平衡时间、冷冻载体和组织块大小对小鼠卵巢组织进行玻璃化冷冻保存。玻璃化冷冻保存的基本程序:取小白鼠卵巢,切块,玻璃化冷冻。玻璃化冷冻效果评判的方法是解冻玻璃化冷冻保存的卵巢组织块,收集其中的未成熟卵,体外培养和体外受精,观察其体外成熟、体外受精及所形成胚胎的发育能力。结果表明,小鼠卵巢组织玻璃化冷冻保存以卵巢组织块大小为1mm3、以半麦管作为载体、在75mL/LED(EG+DMSO)中平衡15min、以用150mL/L ED玻璃化冷冻液处理3min的方法,冷冻保存效果最好。

兔卵巢组织慢速冷冻和玻璃化冷冻保存方法的研究

目的比较不同冷冻方法对兔卵巢组织的保存效果。方法 15只新西兰雌兔,取卵巢皮质切块后,随机分成5组:新鲜组(A组)、二甲亚砜慢速冷冻组(B组)、丙二醇慢速冷冻组(C组)、冷冻管玻璃化冷冻组(D组)及固相表面玻璃化冷冻组(E组)。比较各组卵巢组织的原始和初级卵泡形态正常率;通过体外培养测定培养液中雌二醇(E_2)水平;比较冻融后卵巢组织的内分泌功能;通过TdT介导的dUTP缺口末端标记技术,检测细胞凋亡情况。结果原始卵泡正常形态率与A组相比,B、D组显著降低(P<0.05),C、E组无显著性差异;初级卵泡正常形态率5组间无显著性差异。培养14 d后,各实验组原始卵泡形态正常率均低于A组(P<0.001),各实验组间无显著性差异;组间初级卵泡形态正常率无明显差异。体外培养过程中,培养液E_2水平不断增加(P<0.001),慢速冷冻和玻璃化冷冻的E_2平均浓度有显著性差异(P<0.05)。细胞凋亡检测显示,无论是原始卵泡还是初级卵泡,与A组相比,各实验组的卵泡凋亡率均无显著性差异。结论本实验中,慢速冷冻和固相表面玻璃化冷冻均能很好地保存兔卵巢组织,经过体外培养,能保持一定的内分泌功能。

慢速冷冻和玻璃化冷冻对人类卵巢组织中卵泡形态的影响

【目的】比较慢速冷冻、麦管玻璃化冷冻和尼龙网玻璃化冷冻对人类卵巢组织中卵泡形态的影响。【方法】16例人卵巢组织切成薄片随机分配到新鲜卵巢组(A组)、麦管玻璃化冷冻组(B组)、尼龙网玻璃化冷冻组(C组)和慢速冷冻组(D组)后行组织学和电镜检查。【结果】A、B、C、D组中形态正常的原始卵泡比例分别为72.5%±8.4%、65.6%±12.8%、66.1%±11.1%、48.4%±13.3%;形态正常的初级卵泡比例分别为62.0%±13.9%、58.1%±7.9%、59.0%±16.2%、37.0%±14.0%。D组中形态正常的原始卵泡比例和初级卵泡比例均明显低于A、B、C组。B、C组形态正常的原始卵泡比例和初级卵泡比例,与A组相比无统计学差异。B、C组中形态正常的原始卵泡超微结构无明显改变,D组中形态正常的原始卵泡超微结构存在一定程度的改变。【结论】玻璃化冷冻是人类卵巢组织较适宜的冷冻保存方法。

兔卵巢组织玻璃化冷冻的实验研究

目的:探讨玻璃化冷冻法保存兔卵巢组织的效果。方法:随机将25只新西兰雌兔分为对照组(5只)、慢速冷冻组(10只)和玻璃化冷冻组(10只),比较各组冻融前后卵巢组织学、超微结构、卵泡凋亡(原位末端标记法,TUNEL)和子宫系膜内移植后卵巢功能的恢复情况。结果:新鲜组织、慢速冷冻复苏组织和玻璃化冷冻复苏组织中正常形态卵泡比例分别为87.36%、81.96%和82.72%,两冷冻组正常卵泡比例均低于对照组,差异有统计学意义?P(0.05),但玻璃化冷冻组与慢速冷冻组差异无统计学意义(P>0.05)。3组间卵泡凋亡比率分别为21.4%、13.5%和17.1%,差异无统计学意义(P>0.05);3组移植后兔动情周期出现率均为100%,动情周期出现天数差异无统计学意义?P>0.05);移植存活的卵巢组织内可见各级形态正常的卵泡发育。结论:玻璃化冷冻可有效保存卵巢组织的结构和功能,是一种简单、可行的兔卵巢组织冷冻保存法。

科学家首次实现鸡冷冻卵巢组织活体复原

遗传材料的冷冻保存与复苏对畜禽遗传资源保护具有重要意义,由于家禽的繁殖特性和遗传材料的低温生物学特性,冷冻保存与复苏技术一直是难点,长期制约我国家禽遗传资源的高效保存。5月11日,中国农业科学院北京畜牧兽医研究所蛋鸡遗传育种创新团队利用原位移植技术,在白来航母鸡中成功移植了横斑洛克黑羽鸡冷冻卵巢组织,并成功孵化出一只横斑洛克黑羽雏鸡,首次实现了鸡冷冻卵巢组织活体复原。

玻璃化冷冻对人类卵巢皮质组织形态学和凋亡的影响

【目的】检测玻璃化冷冻方法对人卵巢皮质组织形态学和凋亡情况的影响,为其进一步应用于肿瘤患者卵巢生育力保存的安全性及可行性奠定基础。【方法】卵巢组织来自4例因疾病原因行部分卵巢切除术的患者,术后病理均提示无肿瘤细胞转移或其他干扰实验结果的病灶存在。将获得的卵巢组织分离出皮质切割成薄片,采用自身对照,随机平均分为新鲜对照组(F组)和玻璃化冷冻组(V组),两组薄片进行HE染色后,比较两组卵巢组织冻融前后的卵泡形态与各级卵泡所占比例及组织间质形态,原位末端转移酶标记(TUNEL)技术和Westernblot检测卵巢组织冻融前后细胞的凋亡情况。【结果】F组的原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡分别为(55.5±4.9)%、(34.6±1.6)%和(9.9±7.6)%,V组的各级卵泡比例分别为(51.2±5.1)%、(36.7±1.6)%和(12.1±3.5)%,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05);使用TUNEL法比较两组的组织内细胞凋亡情况,其差异无统计学意义(P>0.05);进一步使用Western Blot法检测两组组织内Cleaved Caspase-3的表达量,其结果与TUNEL法一致,两组间差异无统计学意义(P>0.05)。【结论】玻璃化冷冻法对卵巢组织的形态学和凋亡没有明显的影响,但其大规模临床应用仍有待更多的研究论证。

人类卵巢组织玻璃化冷冻及复苏后形态学及组织增殖活性观察

目的探讨玻璃化冷冻对成人卵巢组织中原始卵泡与初级卵泡的形态学及细胞增殖状态的影响。方法采用液氮直接覆盖玻璃化冷冻(direct cover vitrification,DCV)方法冻存成人卵巢组织块,液氮保存2周后复苏组织。观察和比较冻融前后人卵巢组织中原始卵泡与初级卵泡组织形态学改变;免疫组化染色测定经体外培养48 h后新鲜和冻融卵巢组织中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况。结果冻融前后人卵巢组织内原始卵泡和初级卵泡分布差异无统计学意义(P>0.05);新鲜卵巢组织中,形态异常的原始卵泡比例与初级卵泡比例差异无统计学意义(P>0.05),冻融卵巢组织中,形态异常的原始卵泡比例低于形态异常的初级卵泡比例(P<0.05);新鲜组、新鲜及冻融后培养组均有PCNA的阳性表达,PCNA阳性表达可见于中间型卵泡和初级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞、卵巢组织间质细胞。结论利用DCV方法对人卵巢组织进行冻存能够保存原始卵泡和初级卵泡,冻融过程对原始卵泡和初级卵泡形态结构都可能造成一定程度的损伤,冻融后组织内卵泡有体外生长发育的潜力。

采用不同载体的玻璃化冷冻对人卵巢组织冻存效果的比较研究

目的比较采用不同载体的玻璃化冷冻方案对人卵巢组织的卵泡形态、冻融后体外培养时卵泡生长和激素分泌能力的影响,寻找临床上简便易行且保存效果上佳的人卵巢组织玻璃化冷冻方案。方法将16例患者的卵巢组织切割成皮质小条后随机分配到新鲜组和不同载体玻璃化组,包括冷冻管组、最小微滴组、不锈钢网筛组和固相表面玻璃化组。观察各组卵巢组织卵泡形态;冻融后的卵巢组织行体外培养,比较卵泡生长情况以及培养液中雌二醇和孕酮的浓度。结果冻融后各组原始卵泡正常形态率均低于新鲜组,差异有统计学意义(P<0.05)。冷冻管组、最小微滴组、不锈钢网筛组和固相表面组,原始卵泡形态正常率分别为(64.57±11.84)%、(78.36±7.62)%、(77.21±6.51)%和(84.70±5.03)%。固相表面组原始卵泡形态正常率明显高于其他玻璃化组(P<0.05)。体外培养液中雌二醇和孕酮的平均水平随培养时间逐渐升高。固相表面玻璃化组两种激素平均浓度明显高于其他玻璃化组。培养后卵巢组织中原始卵泡所占比例均较新鲜组下降,生长卵泡比例升高。固相表面玻璃化组培养后生长卵泡比例明显高于其他玻璃化组。结论固相表面玻璃化冷冻可以保存大部分原始卵泡的正常形态,并能较好地保存其体外生长和性激素分泌功能。该技术简便易行且冷冻效果好,适合人卵巢组织玻璃化冷冻的临床使用。

小鼠卵巢组织玻璃化冷冻的初步研究

目的建立一种有效的卵巢组织玻璃化冷冻方法。方法采用乙二醇和蔗糖两步法、小鼠卵巢组织经5m in、10m in、15m in 3种不同的预平衡时间处理,在玻璃化溶液中暴露相同的时间后直接投入液氮进行玻璃化冷冻。复苏后与新鲜的卵巢组织均进行HE染色、提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳。结果玻璃化冷冻复苏后,预平衡时间为10m in的实验组小鼠卵巢组织中的卵泡保持了较好的形态结构。提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳,各实验组与新鲜对照组的结果相似。结论采用乙二醇和蔗糖两步法、预平衡为10m in、直接投入液氮的玻璃化冷冻方法可能是一种有效的卵巢组织片冷冻保存方法。该玻璃化冷冻方法没有造成细胞DNA的损伤。