miR-535靶向GAB2基因通过激活PI3K/AKT信号通路促进山羊颗粒细胞增殖

【背景】MicroRNA(miRNA)是长度为18—25 nt的短RNA分子,在哺乳动物卵巢颗粒细胞调控卵泡发育过程中起着重要作用。团队前期对云上黑山羊高、低产羔数个体卵巢转录组测序结果显示,miR-535能够影响山羊产羔数,但具体调控机制尚不清楚。【目的】通过研究miR-535靶向GAB2(GRB2 associated binding protein 2)及其相关信号通路PI3K/AKT对山羊颗粒细胞增殖的影响,进一步探讨其分子生物学调控机制。【方法】在本研究中,选择具有两胎以上产羔记录的高、低产云上黑山羊各3只,同期发情处理后采集卵泡期卵巢组织,收集原代颗粒细胞。使用荧光定量PCR(reverse transcription-quantitativePCR,RT-qPCR)检测miR-535和GAB2在云上黑山羊高、低产卵巢组织中的表达量。构建GAB2的过表达/干扰载体,使用RT-qPCR、Western blot、免疫荧光、CCK8、EdU和细胞凋亡检测候选基因GAB2对山羊卵巢颗粒细胞增殖的影响。使用miRDB和miRanda软件预测miR-535和GAB2的靶向关系,构建GAB2的野生型和突变型载体,利用双荧光素酶活性检验检测miR-535和GAB2的靶向关系。构建过表达/干扰miR-535载体,探究其颗粒细胞增殖及下游基因功能的影响。【结果】RT-qPCR结果显示,GAB2在高产云上黑山羊卵巢组织中的表达量显著低于低产个体,miR-535的表达则相反(P<0.05);随后,RT-qPCR和Westernblot结果表明,在颗粒细胞中过表达GAB2后,CCND2、CDK4和BCL2的表达量显著升高(P<0.05),BAX的表达量显著降低(P<0.05),抑制其表达则与之相反;EdU和CCK8检测显示,GAB2过表达后显著促进颗粒细胞增殖(P<0.05),抑制其表达后则相反;双荧光素酶报告试验表明,miR-535抑制了GAB2基因3’UTR区域的双荧光素酶活性。RT-qPCR和Western blot结果显示,在颗粒细胞中过表达miR-535后,GAB2、CCND2、CDK4和BCL2的表达量显著降低(P<0.05),BAX的表达量显著升高(P<0.05),抑制其表达后则与之相反;EdU和CCK8检测显示,miR-535过表达后抑制颗粒细胞增殖,抑制其表达后则相反;细胞凋亡试验表明,miR-535过表达后促进颗粒细胞增殖,抑制其表达后则相反。在颗粒细胞中抑制miR-535后,发现PI3K/AKT信号通路标志因子AKT1的表达水平显著升高(P<0.05)。【结论】miR-535通过抑制GAB2的表达,抑制了山羊颗粒细胞的增殖,为进一步探究miR-535调控山羊颗粒细胞的生物学功能提供了理论依据。