重庆市输入性卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种分子特征分析

目的为了解重庆市输入性卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种的分子特征,对卵形疟病例的卵形疟原虫Cox1、Cytb、Tra、Dhfr、K13基因位点多态性进行分析。方法回顾性分析2013-2023年确诊的卵形疟原虫感染患者血样,PCR扩增卵形疟原虫Cox1、Cytb、Tra、Dhfr、K13基因的部分片段,利用测序技术及生物信息学方法区分2个亚种,分析卵形疟curtisi和wallikeri亚种核苷酸多态性位点以及氨基酸突变位点等多态性。结果以ssrRNA区分26例卵形疟(curtisi亚种14例;wallikeri亚种12例)与Cox1、Cytb、Tra基因分类结果一致。Cox1基因在145、153等13个位点呈现二态性,仅在528、862位点氨基酸M176I、I288V变异,单例N337H变异。Cytb基因亚种间发现12个位点发生碱基置换,仅248号氨基酸M248I突变。Tra基因发现49个核苷酸二态性位点,致18个氨基酸突变,curtisi型样本中poc1型比poc2型多PINTINPINTIN和TITPIS氨基酸单元。Dhfr基因突变率较高,25%样本出现S58R突变。K13基因亚种内不呈单态,1例样本为杂合。结论确认了重庆市输入性卵形疟在Cox1、Cytb、Tra、Dhfr、K13基因片段中curtisi和wallikeri亚种间的二态性位点、突变位点,丰富了输入性卵形疟原虫两个亚种基因多态性信息。

卵形疟原虫wallikeri亚种及其基因检测体系的研究进展

近年来的研究发现,以核糖体RNA小亚基(SSU rRNA)为标记基因的巢式PCR体系进行检测时,部分镜检卵形疟原虫阳性血样的结果呈阴性,主要原因是卵形疟原虫wallikeri亚种(Plasmodium ovale wallikeri)的存在。为此本文综述近20年来卵形疟原虫wallikeri亚种的发现和确认的过程,以及在该过程中,开发应用的各种检测卵形疟原虫的方法和体系,为疟疾诊断尤其是卵形疟诊断方面提供技术参考。

山东省14例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种的鉴定

目的对山东省14例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种进行鉴定分析。方法收集14例输入性疟疾病例,进行快速疟疾诊断试纸条检测(RDT)、血涂片镜检、NP-1993常规巢式PCR鉴定和卵形疟原虫wallikeri(P.ovale wallikeri)亚种的特异性PCR检测。PCR扩增产物测序后,进行Blast比对分析。结果 14例患者RDT检测结果:泛疟原虫(非恶性疟)阳性12例,阴性2例;镜检结果,13例卵形疟原虫,1例间日疟原虫;NP-1993常规巢式PCR结果,14例样本4种疟原虫引物扩增结果均为阴性。P.ovale wallikeri亚种的特异性PCR检测结果:14例样本均能扩增到P.ovale wallikeri亚种特异性条带780bp。Blast分析测序结果,检索结果为P.ovale wallikeri亚种。结论 14例镜检阳性、NP-1993常规巢式PCR检测阴性的输入性疟疾病例均确诊为P.ovale wallikeri亚种感染。

湖北省首例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种的病原学诊断分析

目的应用巢式PCR技术对1例罕见卵形疟原虫wallikeri亚种进行诊断和鉴定。方法采集初诊为输入性间日疟患者血样,进行疟疾快速诊断试剂盒、显微镜镜检和巢式PCR检测,并进行测序分析。结果该患者疟疾快速诊断试剂盒检测阴性;镜检查见寄生于红细胞内的疟原虫环状体和滋养体;采用卵形疟原虫wallikeri亚种特异性引物(rOVA1v/rOVA2v)进行巢式PCR,在760bp处有特异性扩增条带,测序后经Blast比对,与GenBank数据库中卵形疟原虫wallikeri亚种部分序列的一致性为99%。结论该患者经巢式PCR和序列分析确诊为湖北省首例卵形疟原虫wallikeri亚种感染。

2015年重庆市3例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种感染病例的实验室诊断

目的分析重庆市2015年3例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种感染病例病原、抗原及核酸检测过程,减少卵形疟原虫的漏诊和误诊。方法收集流行性病学资料及血样,按照WS259-2015疟疾的诊断标准对3例血样进行血涂片镜检、快速疟疾诊断试纸条检测(RDT)及巢式PCR检测。结果 3例患者均为非洲务工归国人员,并都有疟疾发病史。血涂片镜检结果,3例血样均为疟原虫阳性。RDT检测结果3例均为除恶性疟以外其他疟原虫阳性。国家参比实验室推荐的巢式PCR检测DNA,3例均为阴性。用卵形疟原虫wallikeri亚种的种特异性引物的PCR检测,3例均为阳性。结论根据镜检、RDT和卵形疟原虫wallikeri亚种种特异性PCR检测确定,重庆市2015年首次发现了3例卵形疟原虫wallikeri亚种感染输入病例,为重庆地区首次发现。

检测4种人体疟原虫多重PCR体系的建立和应用

目的 应用新建的多重PCR体系检测4种人体疟原虫。 方法 应用DNAman软件比较分析4种人体疟原虫的18S rDNA基因序列，采用Oligo 6.0软件，在其第5和第6保守区间的变异区设计4条下游引物序列，并以含4种疟原虫18S rDNA部分序列的质粒DNA为模板，检测多重PCR体系的特异性和敏感性。此外，将新建的多重PCR体系与NP-1993体系的第1轮属特异引物组合，形成新的巢式PCR扩增体系（M-Nest体系），并用该体系和新建的多重PCR体系对不同稀释倍数的恶性疟和间日疟患者血样DNA进行扩增，检测这两种体系的敏感性。应用M-Nest体系和NP-1993体系检测广西2013年自加纳疟疾高流行区返乡人员的307份血样，比较两者的检测结果是否一致。最后，应用M-Nest和NP-2002体系对广西2014年1～5月份报告的66份镜检以卵形疟原虫感染为主的血样进行复核，比较两者的检测结果是否一致。 结果 应用新建的多重PCR体系得到的恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和间日疟原虫的扩增片段大小分别为268、446、394和323 bp，且不同原虫的扩增条带恰好位于50 bp DNA标志物条带之间，更易于区分，但不同疟原虫的Tm值较为接近，不易区分和鉴别虫种。新建体系对4种疟原虫18S rDNA基因的最低检出浓度分别为：恶性疟原虫5.58×102 拷贝/μl，三日疟原虫1.56×103 拷贝/μl，卵形疟原虫1.66×103 拷贝/μl，间日疟原虫1.80×102 拷贝/μl。新建体系对恶性疟原虫血样的最低检测浓度为1.43×102～8.84×103 拷贝/μl或5.10×10～4.92×102个原虫/μl，高于间日疟原虫的17.4～69.1 拷贝/μl和13.5～83.2个原虫/μl。与单独的多重PCR体系相比，应用M-Nest检测体系将对疟原虫的最低检测浓度降低了10～100倍。M-Nest体系和NP-1993体系对从加纳返乡的307份血样的检测结果不一致，并且M-Nest体系还检测到2例卵形疟原虫感染，而NP-1993体系则未能检测到该感染。此外，M-Nest体系和NP-2002体系对66份镜检以卵形疟原虫感染为主的血样的复核结果一致。 结论 新建的多重PCR检测体系可同时检测4种人体疟原虫，具有良好的现场适用性。

2013-2021年长沙市输入性卵形疟原虫亚种特征分析

目的 分析长沙市2013-2021年18例输入性卵形疟原虫感染患者的资料,为卵形疟原虫的防治提供参考。方法 对长沙市疾病预防控制中心收集的2013-2021年输入性感染卵形疟原虫患者的血液样本、流行病学调查、临床表现进行回顾性分析。结果 2013-2021年(除2014年外)长沙市每年都有输入性卵形疟原虫病例,2021年检出率最高,达30.0%;在所有检出的18例卵形疟原虫病例中,其中curtisi亚种5例、wallikeri亚种13例;wallikeri亚种原虫感染患者全部出现发冷症状,而curtisi亚种原虫感染患者发冷症状表现不相同;5例curtisi亚种原虫感染患者从西非国家输入1例(20.0%),其余4例(80.0%)从中非国家输入。13例wallikeri亚种原虫感染患者由西非、中非和东非国家分别输入3例(23.1%)、8例(61.5%)和2例(15.4%);18例患者中有两例为复发病例,均为wallikeri亚种原虫感染患者。结论 2013-2021年各年度长沙市输入性卵形疟原虫检出率呈现增高趋势。wallikeri亚种引起的临床症状可能更为严重,患者应当遵循医嘱规则用药,同时预防复发。

染料法荧光PCR鉴别卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种

目的建立染料法荧光PCR快速鉴别卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种。方法比对卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种的网织红细胞结合蛋白2(porbp2)基因,设计特异性引物,建立扩增卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种的染料法荧光PCR方法,进行熔解曲线分析,测定各亚种扩增产物的熔解温度,进行特异性、重复性和准确性评价。结果熔解曲线分析结果显示,建立的方法扩增卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种的熔解温度相差明显,curtisi亚种为74.2℃,wallikeri亚种为75.7℃。该方法虽可检测到其他3种疟原虫,但敏感度较低,卵形疟与其他3种疟原虫的熔解温度差别明显。重复性实验表明,该方法扩增卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种熔解温度变异系数均低于1%,重复性良好。对27份卵形疟原虫阳性样本的检测结果与巢式PCR分型结果完全一致。结论建立的染料法荧光PCR方法可快速对两种亚型卵形疟原虫进行鉴别。

罕见输入性卵形疟原虫wallikeri亚种的PCR鉴定和测序分析

目的应用PCR技术对与间日疟原虫形态相识的卵形疟原虫亚种wallikeri进行鉴定。方法采集1例镜检可疑间日疟输入性疟疾患者滤纸血,采用PCR扩增18核糖体小亚单位RNA(18Small Subunit ribosomal RNA,18S SurRNA)片段,并进行测序分析。结果采用5对引物(rFAL1、rFAL2,rVIV1、rVIV2,rMAL1、rMAL2,rOVA1、rOVA2,rOVA1v、rOVA2v)进行PCR扩增,其中rOVA1v、rOVA2v引物扩增阳性,PCR产物大小为760bp;测序分析该基因片段(GenBank accession number KJ786425)与GenBank数据库中Plasomdium ovale wallikeri克隆RSH10 18S rRNA基因部分序列(KF219561.1)及卵形疟ssrRNA基因(AJ001527.1)的序列一致性都为100%。结论卵形疟与间日疟原虫形态相似,可采用PCR技术确认。本例患者感染的疟原虫经PCR鉴定和测序分析确定为卵形疟原虫变形P.ovale wallikeri变形亚种。

河南省输入性卵形疟原虫2个亚种富色氨酸抗原基因的多态性分析

目的分析河南省2015年输入性卵形疟原虫富色氨酸抗原(Plasmodium ovale tryptophan-rich antigen,Po TRA)基因序列。方法采集河南省2015年22例输入性卵形疟患者的血样,收集患者相关信息。提取血样DNA,用巢式PCR方法扩增Po TRA基因,连接至p MD18-T载体,提取质粒进行测序,在Gen Bank中进行同源性比对,判断卵形疟原虫的亚种,并对其基因长度及种类进行分析。对Po TRA基因的氨基酸序列进行比对,分析氨基酸的差异。用邻接法构建系统进化树,分析样本间的亲缘关系。结果 22例卵形疟中,8例为卵形疟原虫wallikeri亚种(P.ovale wallikeri),占36.4%,Po TRA基因长度有245和299 bp 2种类型,以245 bp为主;14例为卵形疟原虫curtisi亚种(P.ovale curtisi),占63.6%,Po TRA基因长度有299、317和335 bp等3种类型,以299 bp为主。氨基酸序列比对显示,wallikeri亚种的2种基因类型相差2个氨基酸单元(MANPINMANPIN和AITPIN),curtisi亚种的3种基因类型间相差2个氨基酸单元(TITPIS和TINPIN)。系统进化树显示,22例样本分为curtisi和wallikeri 2个亚群,其中curtisi亚群又分为2个亚支,299 bp的样本在同一亚支内,317和335 bp的样本在另一亚支内,亲缘关系更近。结论 2015年河南省输入性卵形疟有curtisi和wallikeri 2个亚种,其Po TRA基因存在多态性,curtisi亚种有3种基因类型,wallikeri亚种有2种基因类型。

四川省输入性卵形疟原虫wallikeri亚种实验室检测分析

目的鉴定四川省疑似输入性卵形疟原虫感染病例wallikeri亚种感染情况,并对2014-2017年全省1 079份复核血样卵形疟原虫wallikeri亚种感染情况进行分析。方法对2018年1-4月四川省10例疑似输入性卵形疟原虫感染病例进行血涂片镜检、快速诊断试纸条(RDT)检测和巢式PCR检测并进行测序分析,同时回顾性检测2014-2017年全省1 079份复核血样卵形疟原虫wallikeri亚种感染情况。结果 2018年1-4月四川省10例疑似输入性卵形疟原虫感染病例镜检结果均为卵形疟原虫阳性,其中2例存在恶性疟原虫混合感染;RDT检测结果均为疟原虫阳性;常规巢式PCR检测除2例结果为恶性疟原虫阳性外,其余均为阴性;采用卵形疟原虫wallikeri亚种特异性引物进行PCR检测,10例均为阳性,序列分析结果显示为卵形疟原虫wallikeri亚种。对2014-2017年全省1 079份复核血样进行回顾性检测,发现2例卵形疟原虫wallikeri亚种与恶性疟原虫混合感染病例,均为2017年报告,此前检测结果为单纯恶性疟原虫感染。结论四川省首次鉴定发现输入性卵形疟原虫wallikeri亚种感染病例。

15例输入性卵形疟经典curtisi亚种的特征分析

目的分析15例输入性卵形疟经典curtisi亚种患者的流行病学、临床表现以及实验室检查结果,为减少输入性卵形疟的误诊和漏诊提供参考。方法对安徽省立医院感染病院2014年1月至2018年6月收治的15例输入性卵形疟经典curtisi亚种患者的流行病学、临床表现、实验室检查进行回顾性分析。结果15例患者均为出国劳务男性,年龄27~60岁,以尼日利亚最多(5例),大部分患者有疟疾既往感染史,最多高达7次。所有患者均有不同程度的发热症状(36.5~41℃),热退后15例(100.00%)伴有出汗,此外伴寒战12例(80.00%);脾肿大8例(53.33%);头晕头痛、急性面容各7例(46.67%);腰酸6例(40.00%);关节酸痛5例(33.33%);乏力4例(26.67%);深色尿3例(20.00%);食欲减退、胸腔积液、肺炎、有出血倾者各2例(13.33%)。实验室检查中镜检、免疫法和PCR法检测的阳性率分别为73.33%、66.67%和100.00%,并确诊输入性卵形疟经典curtisi亚种;患者血样疟原虫乳酸脱氢酶(pLDH)基因经测序比对共检测到2种突变:15例样本表现出共有的A122V突变;1例样本出现K245I突变。结论输入性卵形疟临床表现复杂多样,应综合镜检、免疫学和分子生物学等多种检测方法,必要时做基因测序的检查,避免误诊漏诊。