卵形疟原虫wallikeri亚种及其基因检测体系的研究进展

近年来的研究发现,以核糖体RNA小亚基(SSU rRNA)为标记基因的巢式PCR体系进行检测时,部分镜检卵形疟原虫阳性血样的结果呈阴性,主要原因是卵形疟原虫wallikeri亚种(Plasmodium ovale wallikeri)的存在。为此本文综述近20年来卵形疟原虫wallikeri亚种的发现和确认的过程,以及在该过程中,开发应用的各种检测卵形疟原虫的方法和体系,为疟疾诊断尤其是卵形疟诊断方面提供技术参考。

山东省14例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种的鉴定

目的对山东省14例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种进行鉴定分析。方法收集14例输入性疟疾病例,进行快速疟疾诊断试纸条检测(RDT)、血涂片镜检、NP-1993常规巢式PCR鉴定和卵形疟原虫wallikeri(P.ovale wallikeri)亚种的特异性PCR检测。PCR扩增产物测序后,进行Blast比对分析。结果 14例患者RDT检测结果:泛疟原虫(非恶性疟)阳性12例,阴性2例;镜检结果,13例卵形疟原虫,1例间日疟原虫;NP-1993常规巢式PCR结果,14例样本4种疟原虫引物扩增结果均为阴性。P.ovale wallikeri亚种的特异性PCR检测结果:14例样本均能扩增到P.ovale wallikeri亚种特异性条带780bp。Blast分析测序结果,检索结果为P.ovale wallikeri亚种。结论 14例镜检阳性、NP-1993常规巢式PCR检测阴性的输入性疟疾病例均确诊为P.ovale wallikeri亚种感染。

湖北省首例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种的病原学诊断分析

目的应用巢式PCR技术对1例罕见卵形疟原虫wallikeri亚种进行诊断和鉴定。方法采集初诊为输入性间日疟患者血样,进行疟疾快速诊断试剂盒、显微镜镜检和巢式PCR检测,并进行测序分析。结果该患者疟疾快速诊断试剂盒检测阴性;镜检查见寄生于红细胞内的疟原虫环状体和滋养体;采用卵形疟原虫wallikeri亚种特异性引物(rOVA1v/rOVA2v)进行巢式PCR,在760bp处有特异性扩增条带,测序后经Blast比对,与GenBank数据库中卵形疟原虫wallikeri亚种部分序列的一致性为99%。结论该患者经巢式PCR和序列分析确诊为湖北省首例卵形疟原虫wallikeri亚种感染。

2015年重庆市3例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种感染病例的实验室诊断

目的分析重庆市2015年3例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种感染病例病原、抗原及核酸检测过程,减少卵形疟原虫的漏诊和误诊。方法收集流行性病学资料及血样,按照WS259-2015疟疾的诊断标准对3例血样进行血涂片镜检、快速疟疾诊断试纸条检测(RDT)及巢式PCR检测。结果 3例患者均为非洲务工归国人员,并都有疟疾发病史。血涂片镜检结果,3例血样均为疟原虫阳性。RDT检测结果3例均为除恶性疟以外其他疟原虫阳性。国家参比实验室推荐的巢式PCR检测DNA,3例均为阴性。用卵形疟原虫wallikeri亚种的种特异性引物的PCR检测,3例均为阳性。结论根据镜检、RDT和卵形疟原虫wallikeri亚种种特异性PCR检测确定,重庆市2015年首次发现了3例卵形疟原虫wallikeri亚种感染输入病例,为重庆地区首次发现。

浙江省5例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种感染病例的鉴定

目的对浙江省5例镜检阳性、常规巢式PCR检测阴性的输入性疟疾病例进行卵形疟原虫wallikeri亚种(Plasmodium ovale wallikeri)的鉴定与分析。方法收集5例待检病例的流行病学资料和血样,进行镜检、快速疟疾诊断试纸条检测(RDT)和巢式PCR检测(采用疟原虫属特异性引物、种特异性引物和卵形疟原虫wallikeri亚种特异性引物),将PCR扩增片段测序后,与Gen Bank中相关序列进行Blast比对分析。结果 5例疟疾病例均为自非洲归国人员,并有疟疾发病史。镜检结果显示,5例患者均疟原虫阳性。RDT检测结果为泛疟原虫阳性2例,阴性3例。应用常规巢式PCR检测5份血样DNA,4种疟原虫均为阴性。改用卵形疟原虫wallikeri亚种特异性引物进行扩增,结果均为阳性。将5份血样的阳性扩增产物进行测序,所得序列经Blast分析,与Gen Bank中编号为KF219561.1的卵形疟原虫wallikeri亚种clone RSH10 18S核糖体RNA基因的序列一致性均达100%。结论综合镜检和PCR检测结果,证实该5例镜检疟原虫阳性、常规PCR检测阴性的病例均为卵形疟原虫wallikeri亚种感染。

重庆市输入性卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种分子特征分析

目的为了解重庆市输入性卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种的分子特征,对卵形疟病例的卵形疟原虫Cox1、Cytb、Tra、Dhfr、K13基因位点多态性进行分析。方法回顾性分析2013-2023年确诊的卵形疟原虫感染患者血样,PCR扩增卵形疟原虫Cox1、Cytb、Tra、Dhfr、K13基因的部分片段,利用测序技术及生物信息学方法区分2个亚种,分析卵形疟curtisi和wallikeri亚种核苷酸多态性位点以及氨基酸突变位点等多态性。结果以ssrRNA区分26例卵形疟(curtisi亚种14例;wallikeri亚种12例)与Cox1、Cytb、Tra基因分类结果一致。Cox1基因在145、153等13个位点呈现二态性,仅在528、862位点氨基酸M176I、I288V变异,单例N337H变异。Cytb基因亚种间发现12个位点发生碱基置换,仅248号氨基酸M248I突变。Tra基因发现49个核苷酸二态性位点,致18个氨基酸突变,curtisi型样本中poc1型比poc2型多PINTINPINTIN和TITPIS氨基酸单元。Dhfr基因突变率较高,25%样本出现S58R突变。K13基因亚种内不呈单态,1例样本为杂合。结论确认了重庆市输入性卵形疟在Cox1、Cytb、Tra、Dhfr、K13基因片段中curtisi和wallikeri亚种间的二态性位点、突变位点,丰富了输入性卵形疟原虫两个亚种基因多态性信息。

罕见输入性卵形疟原虫wallikeri亚种的PCR鉴定和测序分析

目的应用PCR技术对与间日疟原虫形态相识的卵形疟原虫亚种wallikeri进行鉴定。方法采集1例镜检可疑间日疟输入性疟疾患者滤纸血,采用PCR扩增18核糖体小亚单位RNA(18Small Subunit ribosomal RNA,18S SurRNA)片段,并进行测序分析。结果采用5对引物(rFAL1、rFAL2,rVIV1、rVIV2,rMAL1、rMAL2,rOVA1、rOVA2,rOVA1v、rOVA2v)进行PCR扩增,其中rOVA1v、rOVA2v引物扩增阳性,PCR产物大小为760bp;测序分析该基因片段(GenBank accession number KJ786425)与GenBank数据库中Plasomdium ovale wallikeri克隆RSH10 18S rRNA基因部分序列(KF219561.1)及卵形疟ssrRNA基因(AJ001527.1)的序列一致性都为100%。结论卵形疟与间日疟原虫形态相似,可采用PCR技术确认。本例患者感染的疟原虫经PCR鉴定和测序分析确定为卵形疟原虫变形P.ovale wallikeri变形亚种。

四川省输入性卵形疟原虫wallikeri亚种实验室检测分析

目的鉴定四川省疑似输入性卵形疟原虫感染病例wallikeri亚种感染情况,并对2014-2017年全省1 079份复核血样卵形疟原虫wallikeri亚种感染情况进行分析。方法对2018年1-4月四川省10例疑似输入性卵形疟原虫感染病例进行血涂片镜检、快速诊断试纸条(RDT)检测和巢式PCR检测并进行测序分析,同时回顾性检测2014-2017年全省1 079份复核血样卵形疟原虫wallikeri亚种感染情况。结果 2018年1-4月四川省10例疑似输入性卵形疟原虫感染病例镜检结果均为卵形疟原虫阳性,其中2例存在恶性疟原虫混合感染;RDT检测结果均为疟原虫阳性;常规巢式PCR检测除2例结果为恶性疟原虫阳性外,其余均为阴性;采用卵形疟原虫wallikeri亚种特异性引物进行PCR检测,10例均为阳性,序列分析结果显示为卵形疟原虫wallikeri亚种。对2014-2017年全省1 079份复核血样进行回顾性检测,发现2例卵形疟原虫wallikeri亚种与恶性疟原虫混合感染病例,均为2017年报告,此前检测结果为单纯恶性疟原虫感染。结论四川省首次鉴定发现输入性卵形疟原虫wallikeri亚种感染病例。

恶性疟原虫和卵形疟原虫双重实时荧光PCR检测方法研究

本研究利用SN/T 4793—2017国境口岸疟原虫实时荧光PCR检测方法中恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)特异基因引物探针和自行设计的卵形疟原虫(Plasmodium ovale)特异基因引物探针,对37个疟原虫样本进行鉴定,并建立恶性疟原虫和卵形疟原虫的双重实时荧光PCR检测方法。根据恶性疟原虫和卵形疟原虫的引物探针,优化检测方法,验证其特异性、重复性和灵敏性,建立双重实时荧光PCR方法,为口岸实验室检测机构提供节省人力及试剂成本的便捷准确方法。

江西口岸首例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种感染的PCR鉴定及序列分析

目的对江西口岸1例输入性疟疾病例的血样本进行检测、确认。方法利用普通PCR检测全血样本中疟原虫18S r RNA基因,将得到的测序结果在NCBI数据库进行比对,并结合吉姆萨染色镜检、胶体金快速检测和荧光定量PCR加以验证。结果血涂片镜检并未发现疟原虫,但胶体金快速检测结果为阳性。普通PCR扩增到18S r RNA基因特异性片段,卵形疟原虫特异性引物扩增到阳性条带,而恶性疟、间日疟和三日疟原虫特异性引物没有扩增到目的条带。用卵形疟不同亚型引物特异性扩增发现卵形疟原虫wallikeri亚种阳性,序列与卵形疟原虫wallikeri亚种(Gen Bank号:KF219564.1和KF696359.1)18S r RNA同源性达99%。荧光定量PCR检测亦确认为卵形疟阳性。结论该病例确认为江西口岸首例输入性卵形疟wallikeri亚种感染。

卵形疟原虫感染病例报告一例

目的报告1例卵形疟原虫感染病例的确诊过程。方法采集患者抗凝血样,结合全自动血液分析仪散点图和细胞分类报警信息、瑞氏染色镜检、疟原虫快速诊断试剂盒等方法合力确诊。结果患者经多种方法确诊为卵形疟,给予规范治疗后痊愈。结论患血常规检测中发现散点图异常、细胞分类报警信息有特殊提示时应警惕,镜检结合其他方法可提高阳性检出率。

检测4种人体疟原虫多重PCR体系的建立和应用

目的 应用新建的多重PCR体系检测4种人体疟原虫。 方法 应用DNAman软件比较分析4种人体疟原虫的18S rDNA基因序列，采用Oligo 6.0软件，在其第5和第6保守区间的变异区设计4条下游引物序列，并以含4种疟原虫18S rDNA部分序列的质粒DNA为模板，检测多重PCR体系的特异性和敏感性。此外，将新建的多重PCR体系与NP-1993体系的第1轮属特异引物组合，形成新的巢式PCR扩增体系（M-Nest体系），并用该体系和新建的多重PCR体系对不同稀释倍数的恶性疟和间日疟患者血样DNA进行扩增，检测这两种体系的敏感性。应用M-Nest体系和NP-1993体系检测广西2013年自加纳疟疾高流行区返乡人员的307份血样，比较两者的检测结果是否一致。最后，应用M-Nest和NP-2002体系对广西2014年1～5月份报告的66份镜检以卵形疟原虫感染为主的血样进行复核，比较两者的检测结果是否一致。 结果 应用新建的多重PCR体系得到的恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和间日疟原虫的扩增片段大小分别为268、446、394和323 bp，且不同原虫的扩增条带恰好位于50 bp DNA标志物条带之间，更易于区分，但不同疟原虫的Tm值较为接近，不易区分和鉴别虫种。新建体系对4种疟原虫18S rDNA基因的最低检出浓度分别为：恶性疟原虫5.58×102 拷贝/μl，三日疟原虫1.56×103 拷贝/μl，卵形疟原虫1.66×103 拷贝/μl，间日疟原虫1.80×102 拷贝/μl。新建体系对恶性疟原虫血样的最低检测浓度为1.43×102～8.84×103 拷贝/μl或5.10×10～4.92×102个原虫/μl，高于间日疟原虫的17.4～69.1 拷贝/μl和13.5～83.2个原虫/μl。与单独的多重PCR体系相比，应用M-Nest检测体系将对疟原虫的最低检测浓度降低了10～100倍。M-Nest体系和NP-1993体系对从加纳返乡的307份血样的检测结果不一致，并且M-Nest体系还检测到2例卵形疟原虫感染，而NP-1993体系则未能检测到该感染。此外，M-Nest体系和NP-2002体系对66份镜检以卵形疟原虫感染为主的血样的复核结果一致。 结论 新建的多重PCR检测体系可同时检测4种人体疟原虫，具有良好的现场适用性。

套式PCR扩增特定SSU rRNA基因片段检测四川疟原虫感染的研究

目的用套式 PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染。方法以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸 (SSUr RNA)基因为靶基因 ,选用 1对疟原虫属特异性引物和 4对种特异性引物 ,建立套式 PCR扩增系统并用于四川省疟疾病人血样的检测。结果从间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出 1 0 4 bp、1 0 2 bp和 1 1 5bp预期大小的特定扩增带。61份血样检测结果与镜检的间日疟阳性符合率为 1 0 0 %。并查出镜检漏诊的 2例 P.v.和 P.m.的混合感染及 1例 P.v.、P.f.和 P.m.的混合感染病例。结论本系统特异、灵敏、稳定、简便 ,可在诊断疟疾的同时判定混合感染 ,故对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控有实际应用价值。

1例输入性罕见远期复发卵型疟原虫多重感染的实验室检测分析

目的对1例疟疾复发患者通过实验室多种方法,并结合其临床症状,做出快速准确的诊断。方法对患者进行血常规检查、疟疾快速诊断试剂盒(RDTs)检测和形态学检查,结合其临床症状进行初步诊断;再通过巢式PCR和一代测序的方法,诊断虫种并鉴定亚型。结果通过血常规散点图和RDTs检测的结果,初步判断为疟原虫感染,且排除恶性疟疾的可能;形态学检查判断为卵形疟原虫多重感染,一代测序结果经NCBI中的核酸数据库比对后,鉴定为卵形疟原虫P.ovale curtisi亚型。结论本实验室通过3种方法在短期内明确诊断此病例为输入性罕见远期复发卵型疟原虫多重感染,并鉴定出了虫种亚型。

河南地区两种间日疟原虫子孢子超微结构的研究

间日疟种株的研究,国内尚少报告,近年来,作者等通过自身感染实验,证实河南地区存在两种潜伏期不同的间日疟虫株,为了研究两株疟原虫形态构造上的差异。

超低温疟原虫动物整体保存的实验研究

低温保存疟原虫早有报告,但超低温保存整体疟原虫动物的方法,国内外尚无报导,为此。作者1980年12月至1988年2月创立了这种方法。实验证实,其方法简便易行,保虫量大而成功率高.成为一种疟原虫库。

穆拉姆维亚地区疟原虫阳性检出率调查(附2544例报告)

疟疾是非洲国家发病率较高危害人民健康最常见的热带病之一。我医疗队驻在地穆拉姆维亚省地区,迄今为止,有关疟原虫阳性检出率的资料报道,笔者尚属首次。为初步了解该地区疟原虫阳性检出率,为今后在这一地区工作的医疗队以及在非洲其它国家或地区工作的中国医务工作者提供参考依据,本文累积了自1988年1月至1991年12月。

间日疟原虫多核亚种发作周期和临床症状的初步报告

自1960年—65年,河南省间日疟原虫多核亚种的红内期形已经有了较详尽的报告,但对它的发作周期和临床症状方面的研究还很少。目前所知者只有江静波、马鸿徵(1961)报告了两个病案,张绍武(1965)报告了一个病案,同时一般认为本虫所引起的临床症状是比较重的,并可以引起脑神经症状。但是还缺乏较详细的具体资料予以证实。本文是报告我们在开封县进行研究的结果。对本虫的流行情况、发作周期以及临床症状等方面,作一初步的探讨。 一、间日疟原虫多核亚种在开封流行情况: 间日疟原虫多核亚种在河南开封及其附近是非常普遍的。我们选择血检中证实是本虫引起的39个病例进行统计和分析。

2013-2021年长沙市输入性卵形疟原虫亚种特征分析

目的 分析长沙市2013-2021年18例输入性卵形疟原虫感染患者的资料,为卵形疟原虫的防治提供参考。方法 对长沙市疾病预防控制中心收集的2013-2021年输入性感染卵形疟原虫患者的血液样本、流行病学调查、临床表现进行回顾性分析。结果 2013-2021年(除2014年外)长沙市每年都有输入性卵形疟原虫病例,2021年检出率最高,达30.0%;在所有检出的18例卵形疟原虫病例中,其中curtisi亚种5例、wallikeri亚种13例;wallikeri亚种原虫感染患者全部出现发冷症状,而curtisi亚种原虫感染患者发冷症状表现不相同;5例curtisi亚种原虫感染患者从西非国家输入1例(20.0%),其余4例(80.0%)从中非国家输入。13例wallikeri亚种原虫感染患者由西非、中非和东非国家分别输入3例(23.1%)、8例(61.5%)和2例(15.4%);18例患者中有两例为复发病例,均为wallikeri亚种原虫感染患者。结论 2013-2021年各年度长沙市输入性卵形疟原虫检出率呈现增高趋势。wallikeri亚种引起的临床症状可能更为严重,患者应当遵循医嘱规则用药,同时预防复发。