卵母细胞玻璃化冷冻与胚胎玻璃化冷冻移植周期的临床妊娠及围产期结局比较

目的:比较卵母细胞玻璃化冷冻与胚胎玻璃化冷冻移植周期临床妊娠及围产期结局的差异。方法:回顾性分析2011年1月至2021年6月在郑州大学第三附属医院生殖医学科接受卵裂期胚胎移植患者的临床资料。选取玻璃化冷冻卵母细胞解冻行卵胞浆内单精子注射(ICSI)后新鲜卵裂期胚胎移植周期77个(卵母细胞冷冻组),和同期利用倾向性评分1∶4匹配后得到的新鲜卵母细胞行ICSI后卵裂期胚胎玻璃化冷冻复苏移植周期293个(胚胎冷冻组)。比较2组移植后临床妊娠及围产期结局。结果:卵母细胞冷冻组与胚胎冷冻组临床妊娠率(50.65%vs 46.76%)、早期流产率(12.82%vs 11.68%)及活产率(37.66%vs 39.72%)差异均无统计学意义(P均>0.05),剖宫产率(79.31%vs 83.33%)、胎膜早破发生率(10.34%vs 9.65%)及妊娠期高血压疾病发生率(10.34%vs 9.65%)等差异均无统计学意义(P均>0.05),单双胎分娩早产率(18.75%vs 6.41%,46.15%vs 41.67%)、出生体重[(3449.38±485.39)g vs(3424.74±511.94)g,(2515.20±539.46)g vs(2597.08±523.44)g]差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论:卵母细胞玻璃化冷冻与胚胎玻璃化冷冻移植周期临床妊娠和围产期结局相似,是一种相对安全的辅助生殖技术。

三种抗氧化剂对斑马鱼卵母细胞冷冻保存效果比较

为研究抗氧化剂对斑马鱼卵母细胞冷冻保存效果的影响,在基础冷冻保护液配方中分别添加褪黑素、谷胱甘肽和甜菜碱等3种抗氧化剂进行了冷冻保存试验,比较冷冻后卵母细胞的活性氧(ROS)含量、总抗氧化能力(T-AOC)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)含量、琥珀酸脱氢酶(SDH)活性、凋亡基因表达水平和存活率。试验结果显示:经过筛选,3种抗氧化剂的最优添加浓度分别为褪黑素1×10^(-3) mol/L、谷胱甘肽5×10^(-4) mol/L、甜菜碱1×10^(-3) mol/L。与对照组相比,添加最优浓度抗氧化剂的3个试验组(褪黑素组、谷胱甘肽组和甜菜碱组)的ROS含量均显著降低,ATP含量和SDH活性均显著提高,褪黑素组和甜菜碱组的T-AOC水平显著提高(P<0.05);褪黑素组卵母细胞的caspase3、caspase9和bax基因表达量显著降低,bcl-2基因表达量则显著升高(P<0.05);谷胱甘肽组卵母细胞的caspase3基因表达量显著下降,bcl-2基因表达量显著上升(P<0.05);甜菜碱组卵母细胞的caspase9和bax基因表达量显著降低(P<0.05)。复苏后的卵母细胞在体外培育120 min,褪黑素组、谷胱甘肽组、甜菜碱组卵母细胞的存活率分别比对照组提高10.13%、14.20%和15.99%;冷冻保存1、7、30、60、90 d,3个试验组卵母细胞的存活率均显著高于对照组(P<0.05);冷冻保存90 d,褪黑素组、谷胱甘肽组、甜菜碱组的存活率分别提高了9.05%、7.34%、6.68%。试验结果说明,在斑马鱼卵母细胞冷冻保存过程中添加1×10^(-3) mol/L褪黑素或5×10^(-4) mol/L谷胱甘肽或1×10^(-3) mol/L甜菜碱,均能够增强冷冻保存后卵母细胞的线粒体功能,降低细胞氧化应激水平,减少细胞凋亡,从而提高斑马鱼卵母细胞冷冻效率。

哺乳动物卵母细胞和胚胎冷冻保存研究进展：现存问题与未来展望

在过去的几十年中,哺乳动物卵母细胞和胚胎冷冻保存技术因在辅助生殖技术及实际生产中应用广泛,其研究发展尤为迅速.多个物种(包括人)的卵母细胞和胚胎冷冻保存研究获得了受孕和活产的成功佐证,为冷冻保存技术的临床应用提供了理论依据,并成为体外受精不可缺少的环节.尽管哺乳动物卵母细胞和胚胎的冷冻保存技术的研发和应用取得了巨大进展,例如为可能不育的患者贮藏生殖潜能、卵子冻存库的建立以及卵母细胞和胚胎的跨国运输,但成功率仍达不到使用新鲜卵母细胞和胚胎的水平,还存在许多难题有待解决.本文针对低温保存技术中制约冷冻效率和成功率的主要问题进行了综述,旨在解决技术研发中遇到的瓶颈,为改进技术提供借鉴和参考,鼓励低温生物学研究者继续开展深入研究,加快推进冷冻保存技术在人类和动物辅助生殖技术中的实际应用.

卵母细胞冷冻现状

随着延缓生育趋势的逐渐上升,导致女性面临越来越多非医疗相关的生育风险。卵母细胞冷冻为女性生育力保存提供了一种选择,目前普遍采用玻璃化冷冻卵母细胞。冷冻卵母细胞既存在挑战又存在机遇,对于冷冻卵母细胞的方式方法仍旧存在缺陷,这需要生殖医学专家们共同努力来完成该技术的进一步突破。同时很多女性对年龄增加导致生育力下降的认识不足,又对辅助生殖技术可以克服这一问题有一种过于乐观的信任。所以有必要加强生育力保存相关科普,以满足大众的认知需求,提高人们对于包括冷冻卵母细胞在内的生育力保存的认知度。国家或政府也应提供相关方面的医疗保险或补贴以降低人们使用该技术的成本。

家猫卵母细胞与胚胎的冷冻保存及胚胎移植研究进展

随着生物技术日臻完善,配子与胚胎的冷冻保存,尤其是与胚胎移植联合应用已成为濒危物种保护和种质资源保存的重要手段。野生猫科动物属于濒危物种,多数研究选择与其亲缘关系最近的家猫作为研究模型,从而对野生猫科动物加以保护。截至目前,家猫配子与胚胎冷冻保存及胚胎移植的相关研究取得了长足进步,但与其他物种相比仍有许多问题亟待解决。本文简要阐述了国内外有关家猫卵母细胞和胚胎的冷冻保存以及胚胎移植相关的研究进展和发展前景,为今后相关研究和技术开发奠定基础。

猪卵母细胞冷冻保存研究

目的本研究试图通过比较猪卵母细胞超低温冷冻保存方法、冷冻承载工具、冷冻卵母细胞的类型,从而有效地保存猪卵母细胞;方法利用屠宰场卵巢采集的卵母细胞,以台盼蓝染色、二乙酸荧光素(FDA)染色鉴定卵母细胞冷冻后的成活率,以体外成熟和体外受精鉴定卵母细胞冷冻后的发育能力,研究了不同冷冻方法和不同冷冻保护剂对猪卵母细胞的冷冻效果。结果(1)程序化法冷冻保存中,9%乙二醇(EG),10%二甲基亚砜(DMSO),10%甘油(Gly)均对猪MII期卵母细胞有冷冻保护作用,极显著高于对照组(FDA染色成活率33.8%,25.8%,23.5%vs2.5%,P<0.01),且以9%EG的效果最好,显著高于另外两组(33.8%vs25.8%,23.5%,P<0.05)。(2)玻璃微细管(GMP)法是猪卵母细胞超低温冷冻的较好方法,以普通的麦管(Straw)法进行的程序化冷冻为对照组,GMP管法显著提高猪卵母细胞的冷冻成活率(分别为63.3%和34.5%,P<0.05)。(3)在玻璃化冷冻方法中,不同的冷冻液载体对猪卵母细胞冷冻成活率有影响。以EFS40为冷冻液,Straw和GMP管作冷冻液载体,卵母细胞的成活率分别为45.0%和65.9%,二者差异显著(P<0.05)。(4)用Straw的程序化冷冻法和用GMP管的玻璃化冷冻法对猪GV期卵母细胞冷冻均有效,但二者差异显著(成活率分别为30.0%和59.7%,P<0.05)。冷冻后继续培养,分别有2.8%和6.3%的卵母细胞周围颗粒层发生扩散。(5)冷冻对MII期卵母细胞的发育潜能影响较大,用新鲜精液使其受精,仅有4.9%的受精卵分裂,极显著低于对照组的49.5%(P<0.01);发育至4-细胞期的比例为1.7%,但未能发育至8-细胞期以上胚胎。结论选用MⅡ期卵母细胞、以GMP管为冷冻承载工具、应用玻璃化冷冻方法能够较好地保存猪卵母细胞,为进一步完善猪卵母细胞超低温冷冻保存技术体系提供了参考依据。

牛体外成熟卵母细胞冷冻保存的研究

本实验探讨了用６种不同方法冷冻保存的牛体外成熟卵母细胞体外受精后的发育潜力及其冷冻损伤。尽管用不同方法冷冻的牛卵母细胞多数（８６．１％）形态正常，仅体外受精后的受精率（３０．０％）和卵裂率（７．４％）明显低于对照组（６９．０％和５２．９％），卵裂后继续发育的能力严重受损。在６种冷冻方法中，１．６Ｍ丙二醇分步平衡、程序冷冻效果最好，受精率和卵裂率分别达３６．４％和１３．５％。冷冻后卵母细胞发育潜力下降的原因是皮质颗粒胞吐引起的透明带变硬及亚细胞结构损伤。玻璃化法冷冻的卵母细胞损伤较轻，是值得进一步研究的一种方法。

玻璃化冷冻保存牛卵母细胞技术研究

采用一步法和二步法研究玻璃化冷冻保存的牛生发泡 (GV )期和体外成熟 (IVM)卵母细胞的发育潜力。结果表明 ,冷冻基础液 PBS和 TCM199在玻璃化冷冻中的效果差异不显著 (P>0 .0 5 ) ;冷冻程序和卵母细胞发育阶段对冷冻效果有明显影响 ,二步法冷冻效果显著优于一步法 (P<0 .0 5 ) ,IVM卵母细胞冷冻效果显著优于GV期 (P<0 .0 5 )。

牛卵泡卵母细胞冷冻保存后发育潜力的研究

对用３种不同方法（Ａ法：１．０ｍｏｌ／Ｌ甘油平衡，从２０℃开始以１℃／ｍｉｎ的速度降至－℃，植冰，１０ｍｉｎ后以０．３℃／ｍｉｎ降至－３０℃，再以０．１℃／ｍｉｎ降至－３３℃，投入液氮；Ｂ法：１．６ｍｏｌ／Ｌ丙二醇＋０．ｌｍｏ１／Ｌ蔗糖平衡，５℃冰箱中保存１５ｍｉｎ，从Ｏ℃开始按Ａ法中的程序降温；Ｃ法：即玻璃化法）冷冻保存的牛ＧＶ期卵母细胞的发育潜力进行了研究。解冻后，Ｃ组卵母细胞形态正常率显著高于Ａ、Ｂ两组。３种方法冷冻的卵母细胞成熟培养后，平均卵丘扩展率为６０％，其中Ｃ组最高（６９．９％）。卵丘扩展的卵母细胞中，７９．３％发生ＧＶＢＤ，但大多数没有达到ＭＩ期。３组冷冻卵母细胞的体外成熟率、体外受精率分别为１４．２％、８．３％、２０．０％和１０．０％、７．１％、１２．１％，其中Ａ组中有１枚卵裂。

牛卵泡卵母细胞冷冻保存的研究

研究了用 3种不同方法 (A法 :程序冷冻 ;B法 :超快速冷冻 ;C法 :玻璃化冷冻 )冷冻保存的牛 GV期卵母细胞的发育潜力。结果表明 ,解冻后 ,C组卵母细胞形态正常率显著高于 A、B组 ;3种方法冷冻的卵母细胞成熟培养后 ,平均卵丘扩展率为 6 5 % ,其中 C组最高 (6 9% ) ;3组冷冻卵母细胞的体外成熟率、体外受精率和卵裂率分别为 14 .3% ,17.1% ,2 1.6 % ;11.1% ,12 .6 % ,15 .1%和 5 .6 % ,9.1% ,11.1%。结果还表明 :玻璃化冷冻的卵母细胞损伤较轻。

水牛卵母细胞玻璃化冷冻保存

以水牛MII期的卵母细胞为材料,利用玻璃化冷冻液EDS33(16.5%EG+16.5%DMSO+sucrose)对水牛MII期的卵母细胞进行两步法(玻璃毛细管(GMP)和拉细的开口塑料细管(OPS))玻璃化冷冻保存,即卵母细胞首先放入预平衡液(7.5%EG+7.5%DMSO+sucrose)中平衡3 min,再移入玻璃化冷冻液中30 s后装管直接投入液氮。解冻是在蔗糖浓度逐渐降低的解冻液中进行的。解冻后存活的卵母细胞孤雌激活,通过囊胚发育率作为评定卵母细胞冷冻效果的指标。结果发现,GMP和OPS法冷冻保存的水牛卵母细胞解冻后的存活率(分别为96.80%和97.41%)与对照组卵母细胞的存活率(100%)3者之间差异均不显著(P>0.05)。GMP法和OPS法冷冻的水牛卵母细胞激活后的胚胎分裂率和囊胚发育率2者均明显低于对照组(分别为30.58%和28.32%vs50.94%,10.81%和9.38%vs 29.63%,P<0.05),而这2种方法冷冻的水牛卵母细胞激活后的分裂率和囊胚发育率差异均不显著(P>0.05)。这表明GMP和OPS玻璃化冷冻方法可以用于水牛卵母细胞的冷冻,并且玻璃化冷冻的卵母细胞能继续分裂并发育到囊胚。

卵母细胞玻璃化冷冻对胚胎发育及妊娠结局的影响

目的探讨玻璃化冷冻对卵母细胞体外受精、胚胎发育以及妊娠结局的影响。方法将193枚玻璃化冷冻卵母细胞解冻复苏,采用卵胞浆内单精子注射法受精,观察胚胎发育形态,经72 h体外培养后移植。结果成熟卵母细胞解冻复苏率为75.6%,正常受精率为72.6%,卵裂率为88.7%,优质胚胎率为48.9%。共移植19例,9例妊娠,已分娩2例,临床妊娠率为47. 3%。新鲜周期与冻卵解冻周期相比,卵裂率、可移植胚胎率和优质胚胎率均无显著性差异(P>0.05)。结论玻璃化冷冻方法对成熟卵母细胞的胚胎发育及妊娠结局无显著影响。

山羊卵母细胞冷冻保存及其对发育效果的影响

在程序冷冻条件下,冷冻保护剂种类对山羊卵母细胞发育效果有显著影响。对于山羊GV期卵母细胞,解冻后的形态正常率,PROH(83 1%)和DMSO(81 7%)均高于甘油(70 7%)(P<0 05);而体外成熟率则是PROH(20 3%)高于DMSO(14 2%)和甘油(9 8%),DMSO又高于甘油(P<0 05)。对于山羊IVM卵母细胞,解冻后的形态正常率,PROH(84 5%)和DMSO(86 4%)均高于甘油(74 2%)(P<0 05);而受精率则是PROH(23 2%)高于DMSO(17 5%)和甘油(13 1%),DMSO又高于甘油(P<0 05)。冷冻方法和卵母细胞发育阶段对冷冻效果有显著影响。从冷冻方法看,程序冷冻和OPS玻璃化冷冻,GV期卵母细胞的成熟率分别为19 7%、27 6%,受精率为3 3%、8 6%;培养9h卵母细胞的成熟率分别为20 6%、30 9%,受精率为4 4%、10 3%;IVM卵母细胞的受精率分别为20 9%、29 4%,2 细胞率为4 4%、8 8%,均是OPS玻璃化高于程序冷冻,差异显著(P<0 05);从卵母细胞发育阶段看,不论是程序冷冻还是OPS玻璃化冷冻,GV期和培养9h卵母细胞的成熟率、受精率差异均不显著(P>0 05),但受精率均显著低于IVM卵母细胞(P<0 05)。

卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展

随着许多哺乳动物卵母细胞冷冻的成功,哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存技术取得了不断发展。作者列举比较了开口式拉长细管法、电镜铜网法、固体表面法和尼龙环法等多种卵母细胞的玻璃化冷冻保存方法,并对影响卵母细胞玻璃化冷冻保存的细胞骨架等因素进行了阐述。讨论后提出自己的建议。

哺乳动物卵母细胞的冷冻保存方法

卵母细胞的冷冻保存与精子和胚胎的冷冻保存一样,具有许多潜在的应用价值。八十年代以后,卵母细胞体外成熟、体外受精、核移植,基因转移等相继研究成功。把优良品种动物废弃卵巢中的大量卵母细胞冷冻保存,可为这些生物技术提供充足的材料。卵母细胞的冷冻保存也为稀有动物,濒危动物和其它有价值的雌性个体(如基因工程个体)的遗传资源的长距离国际间运输及长期保存提供了可能。在人,卵母细胞冷冻保存可以克服胚胎冷冻保存所引起的一系列伦理道德及法律问题。

哺乳动物卵母细胞冷冻保存研究进展

阐述了卵母细胞冷冻保存在核移植、体外受精、转基因生产及人类医疗等方面的意义,介绍了卵母细胞冷冻保存的方法、机理及冷冻保护剂的种类,论述了冷冻保存对卵母细胞发育的影响等问题。

体内、外成熟卵母细胞的胚胎冷冻-复苏后发育能力的比较

目的比较体外与体内成熟卵母细胞受精后第3天胚胎冷冻-解冻后的发育能力。方法体外成熟组的胚胎来源于在本生殖中心行未成熟卵体外成熟(IVM)治疗的患者(6例)。体内成熟组为同期行常规卵胞浆内单精子注射(ICSI)治疗的患者(22例)。两组患者胚胎移植后多余的胚胎按慢冻法进行冷冻保存。冻胚移植周期时冷冻胚胎按快融法解冻,体外培养约24 h后行胚胎移植。结果体外与体内成熟卵母细胞的胚胎冷冻-解冻后的复苏率、解冻培养后的可移植胚胎率以及临床妊娠率均无显著差异。结论人未成熟卵母细胞在体外培养系统中完成细胞核和细胞质成熟的同时,细胞膜的成熟可能也较充分,受精后的胚胎能够一定程度地耐受冷冻-解冻过程中面临的各种损伤,复苏后,仍能继续发育和着床并获得妊娠。

猪卵母细胞体外成熟与冷冻保存的初步研究

比较从不同卵巢卵泡直径获得的卵母细胞体外成熟能力的差异 ,并研究其冷冻保存效果。结果表明 :在体外成熟培养液中添加 10 % (体积分数 ,下同 )ECS的成熟率 (72 86 % )显著高于添加 10 %NCS (6 2 2 1% ) (P <0 0 5 ) ,而添加10 %pFF则抑制卵母细胞的体外成熟。随着卵泡直径的增大 ,卵母细胞体外成熟能力逐渐增强。采用程序冷冻保存方法 ,培养成熟组的卵母细胞成活率 (35 5 9% )显著高于培养前 (2 4 6 4 % )和培养 2 4h组 (2 3 36 % ) (P <0 0 5 )。培养 2 4h(77 2 2 % )和培养成熟 (72 81% )组 ,卵母细胞解冻后的形态完整率均显著高于培养前 (5 3 2 4 % ) (P <0 0 5 )。

热滞蛋白在低温冷冻保存卵母细胞和胚胎中的作用

近来一些短期或长期保存卵母细胞和胚胎的研究结果表明,热滞蛋白(thermal hysteresis protein,THPs)或称抗冻蛋白(antifreeze proteins,AFPs),在低温(4C)和超低温(-130～-196℃)下,能与细胞膜相互作用,保护卵母细胞和胚胎。热滞蛋白的这种保护作用与其浓度和种类有关,在玻璃比快速冷冻中,所需THPs的最低浓度为40mg/ml,而在慢速冷冻或低温(4℃)短期保存(1～4天)胚胎中,其适宜浓度范围为0.1～1mg/ml,所需浓度取决于THPs的种类。THPs与玻璃化液相互作用,稳定玻璃化液;同时也与细胞膜相互作用,稳定细胞膜,而细胞膜正是玻璃化冷冻时首先受损伤的部位。THPs为冷冻保存人和动物配子提供了新的保护物质。