原癌基因c-erbB2和c-myb经丝裂原活化蛋白激酶和成熟促进因子途径调节卵母细胞的成熟

本研究探讨了原癌基因c-erbB2和c-myb对小鼠卵母细胞成熟的影响及其在调控卵母细胞成熟中与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和成熟促进因子(maturation promoting factor,MPF)的上下游关系。c-erbB2反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)和c-mybASODN均呈剂量依赖方式抑制卵母细胞的生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)率和第一极体(first polar body,PB1)排放率,并显著延迟其成熟时间。小鼠卵母细胞显微注射重组人c-erbB2蛋白和c-myb蛋白后,培养6h其GVBD率分别比对照组上升了23.1%(P<0.05)和32.2%(P<0.05),培养12h其PB1排放率分别比对照组上升了17.3%(P<0.05)和23.5%(P<0.05)。RT-PCR结果显示,小鼠卵母细胞中存在c-erbB2mRNA和c-mybmRNA表达;c-erbB2ASODN能明显抑制卵母细胞中c-erbB2mRNA和c-mybmRNA的表达,c-mybASODN能明显抑制卵母细胞中c-mybmRNA的表达,对c-erbB2mRNA无明显影响;MAPK抑制剂PD98059以及MPF抑制剂roscovitine在抑制卵母细胞成熟的同时,均能阻断显微注射重组人c-erbB2蛋白和重组人c-myb蛋白对卵母细胞成熟的促进作用,但对卵母细胞中c-erbB2mRNA和c-mybmRNA表达无明显影响。Westernblot结果显示,c-erbB2ASODN、c-mybASODN、PD98059、roscovitine均使卵母细胞中MAPK磷酸化水平和cyclinB1含量下降。结果提示,原癌基因c-erbB2、c-myb在卵母细胞成熟中起重要作用,可能是调控卵母细胞成熟中关键蛋白激酶如MAPK、MPF的上游激活物。

表皮生长因子通过间隙连接蛋白调控小鼠卵母细胞成熟的研究

目的探讨表皮生长因子(EGF)促进卵母细胞成熟的作用机制。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,检测性未成熟昆明白实验小鼠未成熟卵母细胞复合体(COCs)和成熟COCs中11种间隙连接蛋白(Cx)基因的表达情况;采用细胞免疫荧光实验,确定Cx43在未成熟/成熟COCs及卵母细胞中的表达部位;将未成熟COCs培养于0μg/L、1μg/L、10μg/L、50μg/L EGF培养基中观察其成熟率;将未成熟COCs培养于10μg/L EGF培养基中,观察0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h和24 h时间点的成熟率;将未成熟COCs和去颗粒细胞未成熟COCs分别培养于10μg/L EGF培养基中24 h,观察其成熟率;将未成熟COCs培养于10μg/L EGF培养基并分别加入0μg/L、0.1μg/L、1μg/L、10μg/L EGF受体(EGFR)抑制剂(AG),培养22~24 h后观察EGFR对EGF的作用;采用Western blot法检测未成熟COCs培养于10μg/L EGF培养基10 min、30 min、1 h和2 h后Cx43的磷酸化水平。结果RT-PCR结果显示,在小鼠未成熟/成熟COCs中Cx43和Cx45高表达。细胞免疫荧光实验结果显示,Cx43在未成熟COCs中表达于颗粒细胞的细胞膜上,在未成熟卵母细胞的细胞膜和透明带上也有高表达,且呈簇状分布;在成熟的COCs中Cx43在颗粒细胞膜上的表达量降低,在成熟卵母细胞中Cx43的表达量减少,且为均匀分布于细胞膜上,在透明带上不表达。培养于10μg/L EGF中的小鼠未成熟COCs的卵母细胞成熟率最高,达86.9%,显著高于其他不同浓度组(P<0.05)。在10μg/L EGF中培养24 h对小鼠未成熟COCs促进成熟的作用最显著,卵母细胞成熟率达86.2%,显著高于其他不同时长组(P<0.05)。将未成熟COCs去颗粒细胞后,培养于10μg/L EGF培养基中24 h后,未成熟COCs的卵母细胞成熟率没有显著变化(P>0.05)。EGFR特异性抑制剂AG能有效逆转EGF促进小鼠卵母细胞减数分裂恢复的作用,即抑制卵母细胞成熟,且1μg/L AG对EGF作用的逆转效果最显著(P<0.05)。Western blot结果显示,在未成熟COCs中,Cx43以非磷酸化形式为主;添加10μg/L EGF,培养10 min后,Cx43以磷酸化形式为主,持续至2 h时,Cx43又以磷酸化和非磷酸化两种形式存在。结论在小鼠未成熟COCs中,EGF可能通过与颗粒细胞上的EGFR结合,使Cx43快速磷酸化,促进卵母细胞减数分裂恢复和卵母细胞成熟。

成熟促进因子及其对卵母细胞成熟调控机制研究的新进展

卵母细胞成熟调控机制一直是发育生物学和生殖生物学领域的热点问题。以现代分子生物学理论为基础 ,科学家们对卵母细胞成熟分裂的分子生物学调控机理进行了大量研究。发现了细胞周期中许多关键的调控因子 :cdc基因、周期蛋白依赖性激酶 (CDKs)及细胞周期蛋白 (cyclin)等。本文对卵母细胞成熟调控的核心调控物质———成熟促进因子 (maturation promotingfactor,MPF)的分子结构、周期变化及其在卵母细胞成熟过程中与丝裂原激活蛋白激酶 (mitogen activatedproteinkinase,MAPK)相互作用关系的最新进展进行了综述。

表皮生长因子促进小鼠未成熟卵母细胞体外成熟的实验研究

目的了解表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对小鼠未成熟卵母细胞体外成熟、受精及胚胎发育的影响。方法将生殖泡(germinal vesicle,GV)期卵母细胞分别在EGF浓度为0(对照)、0.5、1、2.5、5、10ng/ml的培养液中进行体外培养,观察生殖泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)和第一极体(thefirstpolarbody,PB1)排出的情况。将达到MⅡ期的卵母细胞进行体外受精,观察原核和胚胎发育情况。结果EGF浓度为1、2.5、5、10ng/ml组GVBD发生率高于对照组;EGF浓度2.5、5、10ng/ml组PB1排出率高于对照组,其中EGF浓度5ng/ml组的GVBD、PB1发生率最高(P<0.01)。卵母细胞在1、2.5、5、10ng/mlEGF培养浓度下的退化率低于对照组(P<0.05,P<0.01)。卵母细胞的体外受精率、2-细胞和4-细胞胚胎的发生率在EGF浓度为5ng/ml时明显高于对照组(P<0.01)。结论EGF可促进GV期卵母细胞的成熟,对其受精能力和胚胎发展也有促进作用,也可能有抑制卵母细胞凋亡的作用,而EGF以上作用与剂量有关。

成熟促进因子及其对卵母细胞成熟分裂的调控

卵母细胞的成熟分裂调控机理的研究一直是发育生物学领域的一项重要课题 ,因为卵母细胞是动物体内一种高度特化的细胞 ,在其生长发育过程中有许多独特的现象和规律。卵母细胞的成熟分裂有别于一般细胞的有丝分裂 ,究竟是什么机制调控着卵母细胞的成熟分裂过程呢 ?在现代分子生的学基础理论的帮助下 ,科学家们对真核细胞有丝分裂和卵母细胞成熟分裂的分子生物学调控机理进行了大量研究 ,发现成熟促进因子( maturation promoting factor,MPF)是所有真核细胞有丝分裂和卵母细胞成熟分裂的核心调控物质 ,但 MPF的活性又受到其他很多因素的调节 ,致使

班氏促卵助孕汤改善多囊卵巢综合征小鼠卵母细胞的质量

背景:班氏促卵助孕汤改善多囊卵巢综合征卵母细胞质量的分子机制亟待完善补充。目的:探讨班氏促卵助孕汤对多囊卵巢综合征小鼠卵母细胞质量的影响和分子机制。方法:21 d龄雌性昆明小鼠颈部皮下注射硫酸脱氢表雄酮构建多囊卵巢综合征模型,连续给药21 d,记录动情周期及妊娠情况,ELISA检测血清性激素水平,Annexin V染色检测卵母细胞凋亡率,DCFH-DA荧光探针检测卵母细胞内活性氧水平,免疫荧光法观察卵母细胞纺锤体及染色体情况,网络药理学及分子对接验证班氏促卵助孕汤核心有效成分与卵母细胞成熟相关因子(生长分化因子9和骨形态发生蛋白15)结合活性,实时荧光定量PCR和Western blot检测卵母细胞中生长分化因子9和骨形态发生蛋白15的mRNA及蛋白表达水平。结果与结论:①班氏促卵助孕汤中的成分(槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇)与生长分化因子9、骨形态发生蛋白15具有良好的结合活性;②班氏促卵助孕汤能恢复小鼠动情期,改善性激素紊乱和妊娠情况,降低细胞凋亡率、活性氧水平、纺锤体组装异常率、染色体丢失率(P<0.01,P<0.05),促进生长分化因子9、骨形态发生蛋白15 mRNA和蛋白表达(P<0.01,P<0.05)。结果表明,班氏促卵助孕汤可能通过调控生长分化因子9和骨形态发生蛋白15的基因表达,改善多囊卵巢综合征小鼠卵母细胞质量,提高生育力。

卵母细胞成熟过程中蛋白因子的表达和作用

近年来,随着辅助生育技术的日益发展,卵细胞成熟的分子调控机制愈来愈受到人们的重视,其中成熟刺激因子(MPF)、丝裂原激活蛋白激酶家族(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)、cAMP/蛋白激酶A(cAMP/PKA)等蛋白因子在卵母细胞成熟过程起着重要的作用。现就这些因子在卵母细胞成熟过程中的表达和调控研究进展作一综述。

表皮生长因子和促性腺激素对人类卵母细胞体外成熟的影响

目的 :研究表皮生长因子 (EGF)和不同浓度促性腺激素 (Gn)对未成熟卵母细胞体外成熟的影响。 方法 :将EGF添加至卵母细胞培养液中 ,观察EGF Gn联合应用与单独使用Gn对卵母细胞体外成熟的影响 ;分别改变绒毛膜促性腺激素 (hCG)和卵泡刺激素 (FSH)的浓度 ,观察不同浓度的hCG、FSH对卵母细胞体外成熟的影响。结果 :添加EGF可显著提高卵母细胞的体外成熟率 (P <0 .0 5 ) ;提高hCG和FSH的浓度对卵母细胞的培养、受精及卵裂无影响。 结论 :EGF可促进卵母细胞体外成熟 ,明显提高卵母细胞体外成熟率 ;提高Gn浓度对卵母细胞的培养无进一步的促进作用。

血管内皮生长因子对体外成熟绵羊卵母细胞超微结构变化的影响

为研究血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对绵羊卵母细胞体外成熟过程中细胞超微结构变化的影响,根据前期研究结果,在绵羊卵母细胞体外成熟培养液(TCM199+BSA)中添加不同剂量的VEGF(对照组0 ng.mL-1和试验组5 ng.mL-1)进行成熟培养。利用透射电镜技术进行分析,研究结果显示:①VEGF加速了微绒毛的发育和变化,促进了微绒毛游离端斜行插入透明带,增加了细胞内外物质交流和养分的吸收;②VEGF对卵母细胞成熟过程中高尔基体的影响不显著;③发现特征性绵羊卵母细胞线粒体———带帽状线粒体,并且VEGF对线粒体的迁移有一定的促进作用;④VEGF的添加对绵羊卵母细胞体外成熟过程中脂滴数量的增加没有显著的作用,但VEGF减少了小脂滴聚集为大脂滴的数量。

C-ERBB2促小鼠卵母细胞成熟及在表皮生长因子调控小鼠卵母细胞体外成熟中的作用

目的探讨C-ERBB2对小鼠卵母细胞成熟的影响及对表皮生长因子在卵母细胞成熟调控中的作用。方法采用卵母细胞体外培养法,研究反义C-ERBB2寡脱氧核苷酸(C-ERBB2ASODN)对卵母细胞体外自发成熟及对表皮生长因子(EGF)促卵母细胞成熟的影响;利用RT-PCR检测卵母细胞中C-ERBB2mRNA的表达及在不同处理因素作用下卵母细胞成熟过程中C-ERBB2mRNA表达的变化。结果C-ERBB2ASODN能呈剂量依赖方式抑制卵母细胞的生发泡破裂(GVBD)率和第一极体(PBⅠ)排出率,并且能抑制EGF对卵母细胞的促成熟作用。卵母细胞中存在C-ERBB2mRNA,EGF可以增强其表达,C-ERBB2ASODN可减弱EGF促表达的作用。结论C-ERBB2与卵母细胞的成熟密切相关。EGF可直接促进裸卵的成熟分裂,其机制可能与上调卵母细胞C-ERBB2的表达有关。

表皮生长因子和胰岛素样生长因子对水牛卵母细胞胞质成熟的影响

以皮层颗粒(CG)单层分布于质膜下做为卵母细胞胞质成熟的标志,利用CG荧光染色法,研究了不同浓度表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子(IGF-1)及其组合对水牛卵母细胞胞质成熟的影响。结果发现:(1)添加不同浓度的EGF(10、20、30、50 ng/mL)都可以提高胞质的成熟率,但是组间差异不显著(P>0.05);皮质颗粒的分布随着EGF浓度的升高逐步由中间分布向皮层分布转变;(2)在成熟液中添加IGF-130 ng/mL时效果较好,能显著提高卵母细胞胞质的成熟率;皮质颗粒的分布随着IGF-1浓度的升高逐步由中间分布向皮层分布转变,在添加IGF-130 ng/mL时,在皮层分布最好,随着IGF-1量的进一步增加,皮质颗粒又向中间分布转变;(3)添加20ng/mL EGF+30 ng/mL IGF-1组卵母细胞体外成熟率高于添加30 ng/mL的IGF-1组,显著高于添加20 ng/mLEGF组和对照组(P<0.05)。由此表明,EGF和IGF-1对水牛卵母细胞体外成熟有协同作用。

培养时间和表皮生长因子对兔卵母细胞体外成熟的影响

本试验旨在探讨培养时间和表皮生长因子(EGF)对兔卵母细胞体外成熟及受精的影响。分别用切割法和针刺挤压法取经超排后母兔卵巢表面的卵母细胞颗粒细胞复合体(COCs),将COCs分别在不同时间(24、30、36及40h)和在基础培养液中添加不同浓度表皮生长因子(0、50、100ng/mL)进行体外成熟培养并观察其第一极体排出率。结果表明:①针刺挤压法获得COCs数明显高于切割法(P<0.05);②体外成熟培养时间30(36)h的第一极体排出率高于24(40)h(P<0.05);③添加50和100ng/mLEGF组卵母细胞第一极体排出率明显高于对照组(P<0.05)。因此,①兔卵巢卵母细胞的获得方法以针刺挤压法较好;②兔卵母细胞成熟时间以30～36h为宜;③EGF对兔卵母细胞体外成熟有促进作用,在基础培养液中添加100ng/mLEGF为宜。

表皮生长因子对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的探讨表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对小鼠卵母细胞体外成熟及受精的作用。方法在体外成熟液中分别添加0、0.1、1、5、10ng/mLEGF,12h后检查成熟率,并观察EGF对体外受精的影响。结果添加5ng/mL和10ng/mLEGF组卵母细胞第一极体排出率较对照组显著提高(P<0.05),并且5ng/mL组的效果显著高于其他各组(P<0.05);比较培养液中添加以上浓度EGF对体外受精胚发育的影响,结果发现添加5ng/mLEGF虽不能显著提高囊胚发育率(P>0.05),但可显著提高其通过二细胞阻滞率和囊胚孵化率(P<0.01)。结论EGF对小鼠卵母细胞体外成熟及受精有促进作用,可提高体外成熟率及囊胚孵化率,还可促进受精卵通过二细胞阻滞。

血管内皮生长因子对猪卵母细胞体外成熟的影响研究

为了探讨适宜浓度的血管内皮因子(VEGF)对猪卵母细胞体外成熟的影响,以提高猪卵母细胞的成熟效果进而促进胚胎的后期发育,以期为进一步改善猪卵母细胞体外成熟体系提供参考。本研究通过在猪卵母细胞体外成熟培养液中添加不同浓度的VEGF,成熟培养液(TCM199+BSA)中分别添加0ng/mLVEGF对照组、5ng/mLVEGF试验组Ⅰ、50ng/mLVEGF试验组Ⅱ、500ng/mLVEGF试验组Ⅲ的卵母细胞成熟培养后,经孤雌或体外受精和体外培养。结果表明:(1)试验组Ⅰ极显著地提高了猪卵母细胞的成熟率,试验组Ⅱ显著提高了猪卵母细胞的成熟率;(2)成熟的卵母细胞经孤雌激活和体外培养后,试验组Ⅰ极显著提高了孤雌胚胎的卵裂率和囊胚率。试验组Ⅱ显著提高了孤雌胚胎的卵裂率、极显著的提高了囊胚率;(3)成熟的猪卵母细胞经体外受精和体外培养后,试验组Ⅰ显著地提高了体外受精胚胎的卵裂率和囊胚率,试验组Ⅱ显著地提高了体外受精的卵裂率、极显著地提高了囊胚率。说明5ng/mL或50ng/mL的VEGF,有利于促进猪卵母细胞的体外成熟和早期胚胎的发育。

表皮生长因子、成熟时间和牛卵泡液对山羊卵母细胞体外成熟的影响

卵母细胞的体外成熟受多种因素的影响,成熟效率仍有待提高。本实验研究了表皮生长因子(EGF)、成熟时间和牛卵泡液(bFF)对山羊卵母细胞核成熟的影响。培养液中添加10-30 ng/m l的EGF对山羊卵母细胞第一极体(PB1)排出率无显著影响;体外成熟17h时第一极体排出率与成熟19h无显著差异,而明显低于其他组(P<0.05),在成熟19-25h间第一极体排出率没有显著变化;10%bFF在胎牛血清(FBS)有无的条件下对山羊卵母细胞第一极体排出率均无显著影响。结果表明:不同的成熟时间对极体的排除率有一定的影响;而添加一定剂量的EGF、bFF对黄淮山羊卵母细胞的核成熟无明显影响。

原癌基因在介导细胞因子影响卵母细胞成熟中的作用

目的:探讨原癌基因c-erbB_2、c-myb在介导表皮生长因子、肿瘤坏死因子α、内皮素-1及一氧化氮影响卵母细胞成熟中的作用。方法:建立小鼠卵母细胞体外培养模型,观察EGF、TNFα、ET-1及NO供体小剂量硝普钠(SNP)对卵细胞成熟的影响,用RT-PCR和Western blotting方法检测在上述细胞因子作用下卵母细胞c-erbB2和c-myb表达及丝裂原蛋白激酶(MAPK)和成熟促进因子(MPF)含量的变化。结果:EGF(10μg/L)能促进卵母细胞的成熟,使c-erbB_2 mRNA、c-myb mRNA表达上升,伴随MAPK磷酸化水平和cyclinB1含量升高;TNFα(10μg/L)和ET-1(10^(-7)mol/ L)均使卵母细胞中c-erb_2 mRNA和c-myb mRNA表达下降,伴随MAPK磷酸化水平和cyclinB1含量下降,抑制卵母细胞的成熟。小剂量SNP(10^(-5)mol/L)对卵母细胞成熟无明显影响,但能反转二丁酰环磷酸腺苷(dbcAMP)对卵母细胞成熟的抑制作用,使c-erbB_2mRNA和c-myb mRNA表达升高,MAPK磷酸化水平及cyclinB1含量升高,但仍低于对照组。结论:细胞因子对卵母细胞成熟的影响与原癌基因c-erbB_2和c-myb有关,c-erbB_2和c-myb可能是介导细胞因子和MAPK、MPF间调控卵母细胞成熟的上游激活物。

脑源性神经营养因子在卵母细胞成熟过程中的表达与作用

卯泡发育及卵母细胞成熟是一个非常复杂的过程,是一种多种因子相互作用、相互协调的结果。近年来研究脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)不仅广泛分布于神经系统,对神经元的分裂和发育发挥重要作用,而且在生殖系统也有表达。并认为BDNF能够通过某种旁分泌或自分泌的方式促进卵母细胞成熟,尤其是胞浆成熟,从而促进移植前胚胎的发育。但其具体作用机制还不甚清楚,有待于进一步研究。

生长因子对牛卵母细胞体外成熟、体外受精及其体外发育的影响

本研究主要检测α-转移生长因子(TGF-α)及其他生长因子的交互作用对卵母细胞体外成熟及其体外受精后体外发育的影响。从屠宰场收集卵巢,并回收卵母细胞,与生长因子共同培养。然后,通过体外受精和受精卵体外发育培养来检验是否生长因子可提高卵母细胞发育的潜力。本研究共检测了4651枚卵母细胞。试验结果表明,α-转移生长因子可增加卵母细胞发育的潜力,这一作用是通过卵丘细胞的传递进行的。此外,α-转移生长因子和类似胰岛素生长因子的交互作用显著性地增强卵母细胞的发育潜力。然而,β-转移生长因子和表皮生长因子对牛卵母细胞的发育无显著性影响。结果表明,牛卵母细胞体外发育不仅需要一般性的化学物质、氨基酸、维生素,而且需要生长因子进行自身调节。

人重组卵泡刺激素和表皮生长因子对性未成熟小鼠卵母细胞和颗粒细胞复合体体外发育的作用

卵泡刺激素（FSH）对有腔卵泡和排卵前卵泡的促生命作用已被普遍接受，但关于其对腔前卵泡发育的作用报道结果不尽相同，关于表皮生长因子（EGF）对腔前卵泡的作用尚不确切，本研究目的在于探讨人重组卵泡刺激素（rechFSH)和EGF对早期卵泡发育的作用，利用胶原酶消化法从12日龄的小鼠卵巢中分离得到卵母细胞－颗粒细胞复合体（OGCs)(Fig.1)。体外每孔30－40个培养物并分别添加胎牛血清（FBS），rechFSH和EGF。培养物每4天测量卵母细胞和OGCs直径，并每天照相，结果显示，rechFSH显著促进小鼠OGCs 及其卵母细胞的体外发育，这一作用可被EGF进一步增强（P＜0．05）（Fig.2),但到第八天培养结束时，培养后的OGCs卵母细胞要显著小于体内期生长对照组（P＜0．05）（Fig.3)，说明FSH和EGF在卵泡早期发育中起重要作用。