爪蟾卵母细胞抽提物可诱导牛胎儿成纤维细胞发生部分重编程

应用非洲爪蟾卵母细胞抽提物处理和牛胎儿成纤维细胞(Japanese Black cattle fetal fibroblasts,JBCFF),观察处理前后细胞的形态学变化,同时用免疫荧光染色法检测组蛋白的乙酰化状态和OCT4蛋白的表达,并对其多能性标志基因的mRNA表达水平进行定量分析。结果表明,与未处理细胞相比,经抽提物处理和牛胎儿成纤维细胞组蛋白H3K9乙酰化程度与未处理组无显著差异;培养5~6d后细胞聚集形成'克隆簇'中碱性磷酸酶和Oct4蛋白染色阳性;同时也检测到Oct4和Nanog基因在其中的表达,而Sox2基因未见表达;且Oct4、Nanog基因表达量随处理后细胞培养时间的延长(4、5、6d)而呈依次上升趋势。可见,爪蟾卵母细胞抽提物能诱导和牛胎儿成纤维细胞发生部分重编程,恢复其发育全能性,这对牛诱导性干细胞制备方法的探索和体细胞克隆及转基因克隆牛效率的提高具有一定的借鉴意义。

抽提物处理供体细胞对克隆胚胎发育的影响

本研究采用爪蟾卵母细胞抽提物处理和牛胎儿成纤维细胞（JBCFF）,并以发生重编程的细胞为核供体进行体细胞核移植,研究其对克隆效率的影响。分别超排3只爪蟾,收集卵母细胞后提取其抽提物,用BCA蛋白浓度测定试剂盒确定其蛋白含量,SDS-PAGE分析其中所含蛋白的种类。应用细胞膜透化剂Digitonin对建立的JBCFF进行通透处理和PI染色,筛选最适浓度;并用获得的抽提物处理牛体细胞,获得重编程细胞。以发生重编程的体细胞为供体进行核移植,同时比较离子霉素＋6-DMAP和A23187＋6-DMAP两种组合激活后克隆胚的体外发育能力。结果,3个爪蟾卵母细胞抽提物样品的蛋白浓度分别为56.2255、64.6570和71.2158μg/mL,其中所含蛋白种类一致,主要集中在40-55、70-100ku之间。经过连续的筛选,透化剂Digitonin对JBCFF通透处理的最适浓度为7μg/mL,PI染色显示透化效率为55.44%。爪蟾卵母细胞抽提物与体细胞共孵育后继续培养6-7d,细胞聚集形成＂克隆簇＂。分别以＂克隆簇＂细胞和未处理细胞为核供体,制备的重构胚在融合率（92.83%和96.04%）、卵裂率（89.64%和89.78%）和囊胚率（24.06%和23.12%）均无显著差异（P〉0.05）;离子霉素＋6-DMAP和A23187＋6-DMAP两种激活方式对克隆胚胎的分裂率（92.16%和92.28%）和囊胚率（23.21%和24.18%）均无显著影响（P〉0.05）。爪蟾卵母细胞抽提物诱导和牛体细胞发生重编程,并恢复到较低的分化状态,但没有显著促进克隆胚胎的体外发育,可见缺少对胚胎发育起重要作用的重编程过程,还需要继续深入研究。