脲和盐酸胍诱导的卵清溶菌酶分子去折叠过程中各稳定构象态的分布和过渡

以内源荧光光谱和荧光相图法研究了脲和盐酸胍诱导的卵清溶菌酶分子的去折叠过程,结果表明,当变性液中脲和盐酸胍的浓度分别约为4.0和3.0 mol/L时,卵清溶菌酶分子的去折叠过程均存在一个折叠中间态,这两个去折叠过程均符合"三态模型".在卵清溶菌酶分子"三态"去折叠过程的基础上,通过变性剂分子和卵清溶菌酶分子之间的缔合-解离作用,给出了一个定量描述此去折叠过程中卵清溶菌酶分子残余活性率随溶液中脲和盐酸胍浓度变化的方程.该方程包含两个特征展开参数,一个是蛋白质分子从一个稳定构象态过渡到另一个稳定构象态的热力学平衡常数k,另一个是在此过渡过程中平均每个蛋白质分子所结合的变性剂分子数目m.通过这两个特征展开参数能够定量描述脲和盐酸胍诱导的卵清溶菌酶分子天然态、折叠中间态和完全展开态随变性液中脲和盐酸胍浓度的分布和过渡.

盐酸胍诱导的变性卵清溶菌酶分子重折叠过程及其各稳定构象态的分布和过渡

采用变性和非变性电泳、高效凝胶排阻色谱、内源荧光发射光谱和荧光相图以及生物活性测定等方法,研究了盐酸胍诱导的变性卵清溶菌酶分子的重折叠过程及此过程中卵清溶菌酶分子各稳定构象态的分布和过渡.结果表明,当复性液中盐酸胍浓度分别约为5.0和2.4 mol/L时,变性卵清溶菌酶分子的重折叠过程各存在1个稳定折叠中间态,重折叠过程符合'四态模型'.在卵清溶菌酶分子四态重折叠过程基础上,结合盐酸胍与卵清溶菌酶分子之间的缔合-解离平衡,给出了一个定量描述变性剂诱导的蛋白质分子复性过程中蛋白质分子复性率随溶液中变性剂浓度变化的方程.该方程包含2个特征折叠参数,一个是蛋白质分子从一个稳定构象态过渡到另一个稳定构象态的热力学过渡平衡常数k;另一个是在此过程中平均每个蛋白质分子所结合的变性剂分子数目m.通过这2个特征折叠参数能够定量描述盐酸胍诱导的变性卵清溶菌酶完全去折叠态、折叠中间态和天然态分子随复性液中盐酸胍浓度变化的分布和过渡情况.

卵清溶菌酶淀粉样纤维形成的研究

淀粉样纤维与老年性痴呆症、帕金森病和非神经性组织淀粉样变性病等人类疾病相关。运用ThT荧光、刚果红结合、远紫外圆二色、透射电镜的方法研究了不同条件下卵清溶菌酶（HEWL）淀粉样纤维的形成。实验结果表明pH值2．0是HEWL淀粉样纤维形成的必要条件，HEWL淀粉样纤维的形成是一个典型的浓度依赖型过程。三氟乙醇（TFE）对HEWL淀粉样纤维形成影响结果表明中低浓度（低于40％）的TFE加速了溶菌酶淀粉样纤维的形成，其中5％～15％（v／v）的TFE促进效果最为显著，大大缩短了淀粉样纤维的成核期；而高浓度的TFE（50％）则完全抑制了溶菌酶淀粉样纤维的形成。透射电镜直接观察了溶菌酶淀粉样纤维的形态，不加TFE时溶菌酶淀粉样纤维聚集成簇，形成相互缠绕的成熟纤维，而10％的TFE存在时，观察到的形态则主要是短的原纤维，且没有发生纤维的相互交联实验。结果表明溶菌酶形成相互缠绕的成熟纤维主要由弱的疏水相互作用来驱动。

鸡卵清溶菌酶在大肠杆菌中高效表达及其活性测定

根据NCBI公布的鸡卵清溶菌酶（lysozyme，LYZ）蛋白序列按照大肠杆菌密码子喜好性化学合成鸡卵清溶菌酶基因序列。基因经酶切后与表达载体pET15b连接，获得的重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）。重组大肠杆菌经诱导表达和纯化提取后，获取大量高纯度鸡卵清溶菌酶，其纯度达90％以上。试验证明，经纯化的重组鸡卵清溶菌酶活性达到20000U／mg。本研究利用大肠杆菌表达载体成功表达了重组鸡卵清溶菌酶，并探索了简单有效的纯化和活性测定方法。为利用大肠杆菌系统规模化生产重组鸡卵清溶菌酶奠定了技术基础。

抗HEL抗独特型抗体制备及酶功能模拟初探

用针对鸡卵清溶菌酶（ＨＥＬ）不同表位的鼠单克隆抗体（ＭＡｂ１）免疫同系小鼠，取免疫鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合，经过筛选，克隆化，获得了多株分泌单克隆抗独特型（ＭＡｂ２）抗体的杂交瘤细胞株，其中用抗ＨＥＬ酶活性中心的ＭＡｂ１诱导产生的ＭＡｂ２中有两株可以模拟ＨＥＬ的溶菌活性。其溶菌活性在单独作用时较弱，混合作用时增强，但均明显弱于ＨＥＬ本身。结果表明：在以酶分子作抗原的免疫网络中的确存在可以模拟酶生物学功能的抗独特型抗体（即Ａｂ２β），为模拟酶的研究开辟了又一条途径。

肿瘤坏死因子新型免疫抑制剂的构建、表达和鉴定

目的 用鸡卵清溶菌酶(Hen egg-white lysozyme,HEL)T辅助细胞表位序列替换hTNF-α3’末端序列,构建和表达hTNF-α新型免疫抑制剂。方法 将重组的hTNF-α HEL克隆、表达、纯化后进行初步的生物学活性鉴定。结果 DNA测序分析表明,重组的hTNF-α HEL3’末端序列与设计序列完全相同。将其插入pBV220表达载体中,重组菌经42℃诱导4h做SDSPAGE分析,结果显示该免疫抑制剂获得了表达,M_r为17000,其表达量为菌体总蛋白量的30％。Western blot结果证实,该表达蛋白可与抗TNF-α抗体产生免疫反应。对该表达蛋白进行了阴离子交换柱纯化,获得的重组蛋白的纯度可达95％以上。对该蛋白的体外杀伤活性检测表明,该蛋白已完全丧失了TNF-α的体外杀伤活性。结论 上述实验结果证明,TNF-α免疫抑制剂的构建获得了成功,该免疫抑制剂既保持了与TNF-α抗体结合的能力又失去了TNF-α的杀伤活性,为其下一步治疗作用的研究奠定了基础。

单克隆抗HEL抗体在HEL表位分析中的应用

用ＭｃＡｂ分析蛋白质抗原的表位是对传统用ＰｃＡｂ进行表位分析的一个突破。本文以鸡卵清溶菌酶（ＨＥＬ）作为研究模型，用其对ＢＡＬＢ／ｃ鼠进行脾脏免疫，经常规融合、筛选及再克隆，获得了６株稳定分泌抗ＨＥＬ的单克隆杂交瘤细胞株（Ｂ６，Ｂ７，Ｂ８，Ｂ１０，Ｅ３和Ｅ５）。对这６株ＭｃＡｂ采用了ＥＬＩＳＡ相加试验进行分析，结果表明ＨＥＬ上至少存在３个不同的抗原表位（ｅｐ．Ⅰ～Ⅲ）。其中ＭｃＡｂＢ８，Ｅ３。