草兔卵透明带3(ZP3)基因的克隆及序列分析

根据GenBank中欧洲兔ZP3mRNA序列设计特异性引物,以草兔卵巢组织总RNA为模板,通过RT-PCR技术首次克隆得到草兔ZP3cDNA编码区,命名为hZP3(GenBank登录号:KC447289)。生物信息学分析表明:扩增出的hZP3基因编码序列长1 260bp,编码419个氨基酸,包含一个完整的开放阅读框(ORF)。与欧洲兔ZP3基因核苷酸一致性高达96%。预测的ZP3蛋白具有ZP家族典型特征。系统进化树显示其与欧洲兔亲缘关系最近,其次是啮齿目动物,符合物种进化规律。hZP3基因编码区的成功克隆,为进一步利用该基因通过免疫不育手段防治森林草兔危害提供了基础。

重组人卵透明带ZP3蛋白在毕赤酵母中的表达

利用P .pastoris表达人卵透明带ZP3蛋白。设计特定引物从全长hZP3cDNA上扩增含跨膜区序列的人卵透明带ZP3基因片段 ,并在N末端接上串联组氨酸编码序列的重组基因序列 ;扩增片段插入表达载体pPIC9K中 ;线性化后的重组质粒转入P .pastoris中 ,用高浓度G4 18筛选高拷贝菌株 ,然后甲醇诱导目的蛋白表达。用SDS PAGE和Westernblot分析表达产物。结果发现P .pastoris表达的人ZP3蛋白可以分泌到培养液中 ,并且可溶性好。纯化前后的重组人ZP3蛋白均能与兔抗猪ZP3蛋白抗体发生交叉反应 ,证实表达的目的蛋白具有反应原性。

人卵透明带蛋白ZP3a和ZP3b肽段的免疫原性及其抗血清体外抑制人精子-半透明带结合

分析大肠杆菌表达的重组人卵透明带-3(r-huZP3)蛋白两个肽段(r-huZP3a22-176及r-huZP3b177-348)的免疫原性,比较两者抗血清体外抑制人精子-半透明带结合的能力。以制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化的大肠杆菌表达蛋白为抗原, 主动免疫新西兰兔产生抗huZP3a22-176及huZP3b177-348抗血清;通过ELISA测定比较两者的抗体应答水平:以蛋白印迹和免疫组化方法测定两者抗血清同重组表达蛋白、天然人卵ZP以及卵巢组织的反应性;通过竞争性半透明带结合试验 (hemizona assay,HZA)观察两者抗血清体外抑制人精子-ZP结合能力。结果显示:未与大分子蛋白载体耦联的r-huZP3a22-176 和r-huZP3b177-348抗原都在免疫兔中产生了较高的抗体滴度,而且它们的抗血清可识别大肠杆菌表达的各自重组ZP3肽以及人卵细胞表面天然ZP,两者抗血清也都能在体外抑制人精子-ZP结合。由此可见,r-huZP3a22-176及r-huZP3b177-348蛋白具有良好免疫原性,所产生抗血清也都显示出细胞和组织特异性。因此,单一或合并两个huZP3肽段均可作为抗原研制检测不明原因性不孕妇女中是否存在抗自身ZP抗体的诊断试剂盒,另外它们的抗血清也能用于鉴定已知huZP3表位肽段的最小B-细胞表位基序。

卵透明带ZP3的研究及其应用

卵透明带蛋白围绕在卵母细胞外 ,在受精过程中起着重要作用。ZP3蛋白是卵透明带蛋白家族中的重要成员 ,在功能上 ,ZP3作为初级精子受体 ,起始精卵结合和顶体反应。由于ZP3在受精中的重要作用 ,它成为免疫避孕的有效靶点。ZP3蛋白疫苗和DNA疫苗可以诱导机体产生较强的免疫反应 ,导致生育降低 ,同时带来一定程度的副作用。

卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3α的构建及其在体外的表达

目的:构建pVAX1-pZP3α,探讨其在体外的表达,研制卵透明带DNA避孕疫苗.方法:利用基因工程的方法构建卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3α,用脂质体法转染Hela细胞并采用RT-PCR和Westernblot检测卵透明带抗原pZP3α的体外表达.结果:构建了卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3α,并在体外表达系统检测到卵透明带抗原pZP3αmRNA和pZP3α的表达.结论:正确构建了卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3α.

人卵透明带蛋白huZP3a^(22～176)和huZP3b^(177～348)肽段在大肠杆菌中的表达及其纯化

目的:探索将huZP3a22~348蛋白编码基因拆分成两段,分别表达的可行性,并研究表达产物的免疫原性。方法:用PCR技术, 将去N-端信号肽和C-端跨膜区的huZP322~348蛋白编码基因拆成大小相近的两段, 以完整阅读框的形式分别重组插入热诱导型pBV221的多克隆区。结果:大肠杆菌分别特异地表达了可单独或复合应用的huZP3a22~176和huZP3b177~348,在经过抗人ZP3不同抗原区合成肽抗体的蛋白印迹鉴定后, 用改良的制备性PAGE方法分离纯化这两种表达产物。同时用兔抗猪ZP IgGs蛋白印迹试验表明, huZP3a和pZP3b的几个共同线性抗原表位都存在于其肽链的前半区域。结论:通过基因重组技术可获得足够量的huZP3a和huZP3b,这为开展huZP3a和huZP3b的免疫原性以及huZP3诱发人精子顶体胞吐的功能域等研究奠定了基础。

犬卵透明带3(CZP3)DNA疫苗免疫有效降低小鼠生育能力

目的构建以犬卵透明带3(CZP3)为靶抗原的DNA避孕疫苗,并对其免疫效果及抗生育能力进行初步评价。方法提取犬卵巢总RNA,反转录PCR扩增CZP3基因,利用Prot Scale、TMHMM、Signal P、Inter Pro Scan、PREDICT PROTEIN、同源模建等生物信息学方法对CZP3基因进行分析,构建携带目标抗原CZP3的DNA疫苗pc DNA-CZP3,进行小鼠免疫实验,对DNA疫苗的免疫效果、抗生育水平进行综合评价。结果 CZP3基因序列共编码426个氨基酸,其在N端和C端各有1个疏水区,N端前22个氨基酸为信号肽,C端有1个由细胞外到细胞内的跨膜螺旋。CZP3有8个B细胞表位。DNA避孕疫苗pc DNA3-CZP3能够诱导小鼠产生较高的抗体水平,免疫组小鼠平均产仔数显著低于空白对照组和阴性对照组。结论成功构建能显著降低小鼠生育能力的犬避孕DNA疫苗pc DNA3-CZP3。

猪卵透明带ZP3α真核表达载体的构建及体外瞬时表达

目的 :构建猪卵透明带ZP3α真核表达载体 ,为探讨卵透明带DNA疫苗避孕疫苗奠定基础。方法 :采用PCR法获得了去除N端信号肽序列和C端跨膜区序列的猪卵透明带ZP3α的cDNA序列片段 ,以专门用于发展DNA疫苗的质粒pVAX1为载体构建了真核细胞表达质粒pVAX1-pZP3α。通过脂质体转染将之导入HeLa细胞进行体外瞬时表达 ,然后采用RT -PCR和间接免疫荧光技术 (IIF)检测pZP3α在mRNA水平的转录和蛋白质水平上的表达。结果 :真核细胞表达质粒pVAX1-pZP3α构建成功 ,用RT -PCR和IIF技术检测到了pZP3α在HeLa细胞中的转录与表达。结论 :真核表达载体pVAX1-pZP3α的成功构建和表达为研制开发有效的人用卵透明带DNA避孕疫苗奠定了基础。

55K猪卵透明带抗原(ZP_3)的分离纯化

为了获得足量的猪卵透明带55K组分(ZP_3),以便研究其在高等灵长类恒河猴的免疫抗生育效果、生化和免疫学特性,我们根据国内条件建立了一套从猪卵巢分离纯化透明带55K组分的方法,该法包括用排刀切割卵巢回收卵子,热溶提取卵透明带组分(SIZP),Sephacryl S-400柱层析和Hydroxylapatite(HTP)柱层析分离纯化ZP_3、ZP_3的复性等步骤。采用本法,获得了在SDS-PAGE图谱上呈单一蛋白染色带并保留其抗原性的ZP_3纯品。每2000个猪卵巢可得ZP_3纯品10mg以上。

草原兔尾鼠卵透明带3(ZP3)cDNA保守序列的克隆与序列分析

根据 Gene Bank数据库中 5种啮齿目动物卵透明带 3 (ZP3 ) c DNA的序列 ,利用 DNAMAN和 NIH NCBI BLAST同源性分析程序设计了特异性引物。从 6周龄的未孕雌性的草原兔尾鼠卵巢中用柱离心法得到总 RNA,利用反转录技术得到 c DNA,通过特异性引物进行 PCR扩增草原兔尾鼠的 ZP3 c DNA保守序列。将扩增产物连接到 p MD1 8- T载体上 ,通过蓝白斑筛选得到阳性克隆 ,酶切鉴定后进行测序。将其与 Gene Bank中啮齿目动物 ZP3 c DNA进行同源性比较 ,获得了草原兔尾鼠 ZP3 c DNA的保守基因序列 ,与啮齿类同类基因比较 ,具有较高的同源性。

草兔卵透明带3(ZP3)基因真核表达载体的构建与表达

【目的】利用基因重组技术将草兔卵透明带3基因(ZP3)构建到真核表达载体上,并在RK-13细胞中表达ZP3蛋白,为后期的免疫不育研究提供方便。【方法】提取草兔卵巢总RNA,采用RT-PCR方法克隆ZP3基因,将其与pEGFP-N1真核表达载体连接,构建pEGFP-N1-ZP3表达载体,并将载体转入RK-13细胞中进行ZP3表达。利用倒置荧光显微镜、RT-PCR和Western Bolt方法对重组ZP3蛋白表达情况进行观测。【结果】RT-PCR获得长为1 260bp的草兔ZP3基因;成功构建pEGFP-N1-ZP3重组质粒,将其转染RK-13细胞后表达出73ku的重组ZP3蛋白,RT-PCR验证和Western Bolt结果与ZP3基因的理论长度一致。【结论】首次构建了草兔ZP3基因真核表达载体并成功在真核细胞中表达重组ZP3蛋白。

小鼠卵透明带3(mZP3) cDNA的克隆、测序及mZP3 DNA疫苗的构建

卵透明带 3 (ZP3 )蛋白是透明带中的一种主要蛋白 ,在精卵结合过程中作为精子的初级受体起重要的作用 ,抗 ZP3抗体可以阻断精卵的相互作用 ,ZP3被认为是一种潜在的避孕疫苗的靶抗原。本文根据小鼠卵透明带(m ZP3 ) c DNA序列 (1 3 1 7bp)设计了上游和下游引物 ,从小鼠卵巢中提取总 RNA,经 RT-PCR克隆了鼠卵透明带 3基因的 c DNA,将其亚克隆至 p UCm-T载体后利用蓝白斑特性筛选出阳性克隆 ,酶切鉴定后测序比较 ,与Gene Bank小鼠 ZP3 c DNA序列完全相同 ,证明克隆出正确的小鼠 ZP3 c DNA.将 m ZP3克隆至真核表达质粒p CMV4上 ,构建完成了 DNA避孕疫苗的载体 p CMV4-m ZP3 ,为应用

构建表达猪卵透明带抗原(pZP3α)的重组乳酸杆菌

目的:构建表达猪卵透明带蛋白(pZP3α)的重组乳酸杆菌。方法:用PCR方法扩增得到短小乳酸杆菌染色体中的S-层蛋白的信号肽序列和猪卵透明带的pZP3α基因,并依次克隆到乳酸杆菌整合型表达质粒pIlac的lac启动子下游,得到质粒pIlac-pZP3α。将质粒pIlac-pZP3α电穿孔转化干酪乳酸杆菌(L.casei CECT5276),挑选转化后的耐药菌落,在含5μg/mL红霉素的MRS培养基中培养,抽提其基因组DNA做模板,PCR鉴定验证pZP3α基因是否整合到乳酸杆菌的基因组中。筛选重组菌在无红霉素选择压力下传代培养直至发生第2次重组使红霉素抗性基因消失。结果:酶切与测序结果表明信号肽和pZP3α基因正确克隆到载体pIlac中;PCR鉴定证实pZP3α基因成功重组到乳酸杆菌的基因组中,培养50 d后重组乳酸杆菌抗性消失,用斑点免疫印迹化学发光法检测到经终质量分数为0.75%乳糖诱导后的上清中有pZP3α蛋白分泌。结论:成功构建表达pZP3α的重组乳酸杆菌,pZP3α在乳酸杆菌中得到了稳定的、分泌表达。

阿魏菇多糖佐剂增强犬卵透明带3(CZP3)DNA疫苗的免疫不育效果

目的研究阿魏菇多糖(PFP)作为佐剂增强犬卵透明带3(CZP3)DNA疫苗(pc DNA3-CZP3)的免疫不育效果。方法将pc DNA3-CZP3单独或分别与铝佐剂、PFP联用,肌肉注射免疫小鼠3次,采用ELISA测定免疫小鼠抗血清特异性抗体滴度;流式细胞术检测树突状细胞(DC)的成熟和T淋巴细胞增殖;合笼计算窝仔数检测免疫不育效果。综合评价PFP和铝佐剂对CZP3 DNA疫苗免疫效果的影响。结果联用铝佐剂和PFP的pc DNA3-CZP3与单独免疫pc DNA3-CZP3的疫苗组相比,均能提高受免小鼠抗血清特异性抗体水平。PFP作为佐剂能够显著性的增强DC表面成熟标志物CD86+和MHCⅡ+的基因表达水平,促进T细胞增殖,并且显著降低小鼠的生育率和窝仔数。结论 PFP能够提高免疫小鼠的抗体水平,促进DC成熟和增强T淋巴细胞增殖,增强CZP3 DNA疫苗免疫小鼠的不育效果。

草原兔尾鼠卵透明带3DNA疫苗pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3的构建表达及其免疫不育的研究

目的:构建草原兔尾鼠卵透明带3 DNA疫苗pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3进行小鼠的黏膜免疫,增强该疫苗的免疫不育效果。方法:将两种佐剂分子大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基和C3d基因通过酶切鉴定,构建重组质粒pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3,采用RT-PCR和W estern b lot技术,检测其在mRNA和蛋白水平的表达,并通过肌肉注射、滴鼻和灌服3种途径免疫雌性C57BL/6小鼠,通过ELISA检测抗体水平及分型。结果:酶切鉴定,RT-PCR和W estern b lot结果表明重组质粒构建正确并可在mRNA和蛋白水平的表达,ELISA结果表明以重组质粒pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3免疫诱导的特异性IgG、IgA的水平明显高于对照组(P<0.01)。抗生育实验表明该疫苗免疫的小鼠平均生仔数与对照组相比差异极显著(P<0.01)。结论:构建的草原兔尾鼠卵透明带3DNA疫苗重组质粒pVAX1-sig-LTB-lZP3-C3d3可高效地激发小鼠特异性免疫应答,提高抗生育的效果。

小鼠卵透明带3(mZP3)质粒DNA体外瞬时表达的研究

为探讨小鼠卵透明带 3 (mZP3 )质粒DNA在真核细胞中的表达效率 ,筛选出高效表达mZP3的质粒 DNA ,提高DNA疫苗对小鼠的免疫不育效果 ,本研究采用阳离子多聚糖 纳米颗粒Puchio为转染介质 ,将mZP3质粒DNA转染真核细胞COS 7,用半定量 PCR检测mZP3的特异性mRNA表达。结果显示 :Puchio与pcDNA3 mZP3紧密结合 ,在COS 7细胞中有mZP3基因的特异性mRNA表达 ;Puchio的介导可能提高真核细胞的转染效率 ,有助于通过真核细胞的瞬时表达系统筛选出用于小鼠免疫不育的DNA疫苗 ,为深入开展鼠卵透明带

猪卵透明带-3β融合蛋白在E.coli中的表达和鉴定

对全长猪卵透明带－３β（ｐＺＰ３β）ｃＤＮＡ的５端重新测序分析，发现文献报道的该克隆基因５端非编码序列中漏读了两个碱基，继而选择符合ｐＺＰ３βｃＤＮＡ阅读框的ｐＷＲ４５０－２载体质粒，通过双酶切构建了β－半乳糖苷酶／ｐＺＰ３β融合蛋白基因的细菌表达质粒。转化宿主菌后用ＩＰＴＧ诱导，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明ｐＺＰ３β融合蛋白在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得表达，并在蛋白印迹鉴定中能同兔抗猪ＺＰＩｇＧ呈特异性免疫反应。

分子佐剂C3d增强草原兔尾鼠卵透明带3DNA疫苗的免疫应答

为增强免疫不育的效果,探讨分子佐剂C3d对草原兔尾鼠透明带3(LaguruslagurusZonaPellucida3,LZP3)基因免疫的调节作用。构建了含3个拷贝C3d的lzp3基因真核细胞表达质粒pcDNA3-LZP3-C3d3(pcD-LC),以不含C3d的质粒pcDNA3-LZP3(pcD-L)为对照,体外转染HeLa细胞,RT-PCR和Westernblot分别检测到lzp3mRNA和蛋白的表达。对NIH雌性小鼠肌肉进行基因免疫注射,ELISA结果表明pcD-LC免疫诱导的特异性抗LZP3-IgG水平明显高于pcD-L对照组(P<0.05),且有长期免疫应答效应;MTT结果显示pcD-LC能够诱导淋巴细胞增殖活性的提高。抗生育实验表明pcD-LC免疫组显著降低窝产仔数(P<0.05),且卵巢切片正常。研究结果证实C3d能够增强lzp3DNA疫苗的特异性免疫应答并达到抗生育效果,为DNA疫苗控制草原兔尾鼠的深入研究提供了基础。

透明带3多肽诱导的免疫性卵巢早衰小鼠模型子宫组织中Ki-67、ER的表达

目的：以透明带3多肽（pZP3）诱导的免疫性卵巢早衰（POF）小鼠为研究对象，观察其子宫Ki-67、雌激素受体（ER）的表达，以进一步探讨免疫性卵巢早衰患者辅助生殖相关的子宫预处理方案。方法取7~8周龄的健康雌性BALB/c小鼠40只，随机分为对照组和模型组。通过阴道脱落细胞涂片、血清性激素、卵巢组织形态及抗卵巢ZP3抗体鉴定建模成功。检测两组小鼠子宫组织形态变化及子宫Ki-67、雌激素受体α亚型（ERα）及雌激素受体β亚型（ERβ）的表达。结果8周后80%小鼠建模成功。与对照组相比，模型组子宫萎缩，内膜变薄，单位面积内腺体数量减少。模型组子宫内膜上皮细胞、腺上皮细胞及间质细胞中Ki-67的表达较对照组减弱，且有胞核转位至胞浆现象。对照组小鼠子宫内膜上皮细胞、腺上皮细胞及间质细胞的胞浆强表达ERα，而模型组呈阴性表达。两组小鼠子宫内膜ERβ均呈阴性表达。结论 pZP3可以诱导小鼠成功构建免疫性卵巢早衰疾病模型，同时引起子宫内膜上皮细胞及间质细胞的增殖降低和ERα表达减弱。

草原兔尾鼠卵透明带3基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的:探索制备免疫不育疫苗的新途径,获得草原兔尾鼠卵透明带3(LZP3)重组腺病毒减毒活疫苗。方法:将LZP3基因亚克隆到穿梭质粒pShuttle-CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带LZP3基因的重组腺病毒载体。获得的重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞,包装成病毒颗粒。PCR鉴定重组腺病毒,继而用鉴定正确的重组腺病毒感染HeLa细胞,并以RT-PCR、Western blot检测LZP3的转录和表达。结果:成功构建了携带LZP3基因的重组腺病毒pAd-LZP3载体,其转染293细胞后包装出重组病毒,PCR证实LZP3基因已整合至腺病毒基因组中,病毒的滴度可达1.2×1010pfu/L。RT-PCR和Western blot检测表明RAd-LZP3感染的HeLa细胞中LZP3基因能够有效转录和表达。结论:制备的RAd-LZP3可成功表达LZP3基因,为后续开展RAd-LZP3免疫动物的研究奠定了基础。