一种用于宽场荧光显微镜下成像的皮肤厚片免疫荧光染色方法

目的通过改良免疫荧光染色方案,使皮肤厚切片能在宽场荧光显微镜下荧光成像。方法选择成年雄性SD大鼠5只,经Zamboni固定液灌注固定后取后肢足底皮肤,冷冻切片,片厚40μm,行神经纤维标志物PGP9.5免疫荧光染色。首先比较染色后用梯度甘油溶液透明与不经甘油透明对皮肤厚片成像深度的影响;继之在染色后甘油透明的基础上,检测染色前二甲基亚砜(DMSO)处理不同时间(10min、15min和30min)对皮肤背景信号的影响。此外,采用体视显微镜检测梯度甘油透明对切片形态的影响。最后,用上述DMSO-甘油改良染色法进一步对神经纤维其他标志物NF 200和外周蛋白分别进行染色。结果经染色后甘油透明的切片其成像深度显著大于常规染色的切片(P<0.01);在甘油透明的基础上,先用DMSO处理能有效降低皮肤背景着色,时间以15min为佳;梯度甘油处理并不会造成皮肤厚片的形态改变;DMSO-甘油改良染色法也能有效显示皮肤NF200和外周蛋白免疫反应阳性的神经纤维。结论经本改良方法染色的皮肤厚片能在宽场荧光显微镜下良好成像。

成年大鼠脊髓厚片自发荧光特异性消除新方法

目的改良成年大鼠脊髓厚片自发荧光的特异性消除方法。方法利用染色前0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH=6.0)80℃水浴热抗原修复45 min和染色后醋酸铵缓冲的0.01 mol/L硫酸铜溶液(p H=5.0)浸润的独立或者联合处理,特异性消除成年大鼠脊髓厚片漂片法免疫荧光染色中的自发荧光。结果染色前柠檬酸钠酸性缓冲液水浴热抗原修复能够显著消除成年大鼠脊髓厚片自发荧光。在此基础上,染色后短时间醋酸铵缓冲的酸性硫酸铜溶液浸润,即可完全消除这些自发荧光,并不减弱漂片法免疫荧光染色的目标荧光信号。结论柠檬酸钠酸性缓冲液水浴热抗原修复-醋酸铵缓冲的酸性硫酸铜溶液浸润的联合处理比较理想地特异性消除成年大鼠脊髓厚片漂片法免疫荧光染色中的自发荧光。