CFTR氯离子通道在Ⅱ型肺泡上皮细胞高氧损伤机制的研究

目的 研究囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)氯离子通道在Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)高氧损伤中的作用。方法 AECⅡ于密封舱中通入95%O_(2)+5%CO_(2),持续24h或48h,构建高氧损伤AECⅡ模型。将实验组AECⅡ随机分为高氧24h组、高氧24h+激动剂(Gen)组、高氧24h+抑制剂(AA)、高氧48h组、高氧48h+Gen组和高氧48h+AA组;对照组通入空气,未干预。以膜片钳系统记录CFTR氯离子电流强度。细胞外液中分别加入GEN50μM或AA10μM,记录GEN激活或AA抑制后氯离子电流强度。采用Clampfit 10.6行数据分析,应用R4.4.1统计软件对不同组别行Spearman相关性分析。结果 1.高氧24h、48h明显抑制AECⅡ氯离子电流(P<0.01),以24h较明显;2. Gen明显增加高氧24h、48hAECⅡ氯离子电流;AA明显抑制氯离子电流(P<0.01),均以48h较明显。结论 高氧可能通过影响AECⅡCFTR氯离子外流而发挥作用。

基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠

背景:前期在体外成功构建了SENP1基因沉默的人肺泡上皮细胞系,在细胞水平上研究了SENP1在高氧性肺损伤中的作用。目的:基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠模型。方法:将SENP1^(flox/-)小鼠自交得到SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/-)小鼠;将Sftpc-Cre^(+/+)小鼠与野生型小鼠交配获得更多的Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。将Sftpc-Cre^(+/+)或子代Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/-)或子代SENP1^(flox/flox)小鼠进行杂交,获得SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)双杂合小鼠。将SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/flox)小鼠杂交,获得SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。剪鼠尾提取基因组DNA,行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定小鼠基因型。取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织行免疫荧光双标实验及Western blot以验证SENP1敲除效果;取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠心、肝、肺、肾组织行苏木精-伊红染色以观察两组小鼠各脏器的组织形态。结果与结论:琼脂糖凝胶电泳正确筛选出SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。免疫荧光双标实验显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1的平均荧光强度降低(P<0.01),且SENP1和Sftpc未见明显共定位(P<0.01)。Western blot结果显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1蛋白表达降低(P<0.001)。苏木精-伊红染色结果显示SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠的心、肝、肺和肾脏组织形态无明显改变。该研究利用Cre-loxP重组酶系统成功构建了肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠,为后续研究SENP1基因在以肺泡Ⅱ型上皮细胞为主要损伤细胞的肺疾病如支气管肺发育不良、特发性肺纤维化中的作用提供了良好的工具。

脂氧素A4对Ⅱ型肺泡上皮细胞-间质转化的抑制作用及其机制

目的 探讨脂氧素A4(lipoxin A4, LXA4)对Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial typeⅡcell, ATⅡ)间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影响及可能机制。方法 将A549细胞分为对照组、转化生长因子β1(transforming growth factor, TGF-β1)组、空质粒+TGF-β1组、pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1组及LXA4+TGF-β1组。TGF-β1组以5 ng/mL TGF-β1干预A549细胞48 h;空质粒+TGF-β1组和pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1组A549细胞先分别转染空质粒或Nrf2过表达质粒,再以5 ng/mL TGF-β1干预48 h;LXA4+TGF-β1组A549细胞先用100 nmol/L LXA4预处理6 h再给予5 ng/mL TGF-β1干预48 h。光镜观察细胞形态变化,免疫印迹及免疫荧光法检测上皮标志物E钙黏蛋白(E-cadherin)、间质标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)表达;免疫印迹法检测核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)蛋白水平。结果 与对照组相比,TGF-β1组光镜下可见部分A549细胞形态从鹅卵石状变成细长不规则状,呈间质性改变,E-cadherin表达减少(P<0.05)、α-SMA表达增多(P<0.01),Nrf2蛋白水平下调(P<0.05)。与TGF-β1组相比,pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1组A549细胞E-cadherin表达增多(P<0.05)、α-SMA表达减少(P<0.01);LXA4+TGF-β1组A549细胞E-cadherin上调、α-SMA下调以及Nrf2蛋白水平增多(P<0.05)。结论 LXA4可抑制A549细胞发生EMT,其机制与上调Nrf2表达相关。

类视黄醇X受体对缺氧/复氧诱导的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞氧化应激反应的调控作用

目的:探讨类视黄醇X受体(RXR)在缺氧/复氧(HR)诱导的大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)氧化应激反应中的调控作用。方法:随机将细胞实验分成5组:对照(C)组、HR组、HR+溶剂二甲基亚砜(DMSO)组(HD组)、HR+RXR激动剂9-顺式维甲酸(9-RA)组(RA组)和HR+RXR抑制剂HX531组(HX组)。采用CCK-8法检测各组细胞活力;免疫荧光法进行AECⅡ特异性指标表面活性物质蛋白A(SP-A)的鉴定和RXRα表达的观察;试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;透射电镜观察细胞内超微结构的变化;Western blot检测核因子E2相关因子2(Nrf2)蛋白水平;RT-PCR检测Nrf2的mRNA表达水平。结果:与C组相比,HR、HD、RA和HX组细胞活力均显著降低(P<0.05),SOD活性显著下降(P<0.05),MDA含量显著增高(P<0.05),Nrf2的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01),RXRα的免疫荧光表达显著增加(P<0.01);与HR和HX组相比,RA组细胞活力增加(P<0.05),SOD活性上升(P<0.05),MDA含量下降(P<0.05),Nrf2的mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.01),RXRα的免疫荧光表达显著增加(P<0.01)。结论:HR可加剧大鼠AECⅡ的氧化应激反应,RXR激动剂干预后可通过抑制氧化应激反应减轻HR引起的大鼠AECⅡ损伤。

胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离及原代培养

目的:探讨胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar epithelial cell typeⅡ,AECⅡ)的分离、纯化及原代培养方法,为有关胎儿肺发育及新生儿肺部疾病的研究奠定基础。方法:采用胰酶结合胶原酶的消化方法,分离肺组织细胞成份,然后经差速离心和差速贴壁的方法纯化AECⅡ,进行原代培养;通过台盼蓝染色检测细胞活力,倒置相差显微镜观察细胞生长特点及形态特征,透射电镜鉴定,改良巴氏染色检测细胞纯度以及免疫荧光技术检测表面蛋白C(Surfactant proteinc,SPC)的表达。结果:每3～5只胎鼠可获得AECⅡ(36±5)×106,活力98%±2%。镜下观察原代AECⅡ呈岛状生长,外观呈多边形或立方形。透射电镜可见特征性的板层小体,改良巴氏染色见胞质内有较多颗粒,纯度为96%±3%,呈现SPC绿色免疫荧光的细胞占96%以上。结论:利用胰酶和胶原酶消化,以及差速离心和差速贴壁的方法可成功分离出高产量、高纯度的胎鼠AECⅡ,能满足体外进一步实验的需要。

胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离、原代培养与鉴定

【目的】探讨胎鼠肺泡Ⅱ型细胞原代培养及鉴定方法,建立肺泡Ⅱ型细胞培养模型,为体外研究肺泡Ⅱ型细胞及胎儿肺发育提供实验手段。【方法】采用低浓度胰酶消化20d胎鼠肺组织,经差速离心和特异性免疫吸附后,分离、纯化胎鼠肺泡Ⅱ型细胞,进行原代培养;根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和肺表面活性特异蛋白A的分泌,用免疫细胞化学染色、透射电镜及酶联免疫吸附法对分离的细胞进行形态学和功能鉴定。【结果】原代培养的肺Ⅱ型细胞12h开始贴壁,外观呈多边形,岛状生长。培养的24～48h,细胞连接成单层,胞浆内颗粒明显,培养的6￣7d细胞内颗粒大量减少;免疫细胞化学鉴定细胞肺表面活性特异蛋白A(surfactantproteinA,SP-A)染色阳性,透射电镜可见观察到细胞内板层小体,培养液中SP-A含量随培养时间延长逐渐增多,于培养36h达峰值,为80ng/mL;细胞纯度达(92±2)%,产量为(18.6±7)×106。【结论】差速离心和免疫黏附法是一种高效的分离和纯化胎肺Ⅱ型细胞的方法,所得细胞产量大、纯度高,可以用于体外研究肺泡Ⅱ型细胞和晚期胎肺发育的研究。

构建原代分离培养与鉴定小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的方法及模型

背景:肺泡Ⅱ型上皮细胞在肺发育和肺功能调节中起重要作用,它与肺纤维化和肺癌等疾病的发生发展有密切联系,为了对这些疾病进行体外实验研究,必须对肺泡Ⅱ型上皮细胞进行分离、原代培养与鉴定以建立一个稳定高效的细胞模型。目的:建立一套可靠的小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离、纯化、原代培养与鉴定的方法,为肺纤维化及肺癌等疾病的进一步研究奠定基础。方法:①用低浓度胰酶联合Ⅰ型胶原酶消化法,分离小鼠肺组织细胞成分。取出小鼠肺组织,剪成小块,加入胰蛋白酶,移出细胞悬液,加入含胎牛血清的DMEM中止消化;同法用胰蛋白酶再消化1次,中止消化后加入Ⅰ型胶原酶,再中止消化。②经差速离心差速贴壁和免疫黏附法纯化肺泡Ⅱ型上皮细胞,进行原代培养。将肺细胞悬液接种入包被小鼠IgG的培养皿中培养,吸出含未黏附细胞的液体接种于另一包被小鼠IgG的培养皿中培养,吸出未黏附细胞,去上清,重悬沉淀,将细胞接种于培养皿和培养板中培养。倒置显微镜观察细胞形态及生长特点,测定肺泡Ⅱ型上皮细胞产量、纯度及活力,免疫细胞化学染色鉴定肺泡表面活性蛋白A和肺泡表面活性蛋白C的表达,透射电镜鉴定肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性细胞结构。结果与结论:用此方法,每只小鼠获得肺泡Ⅱ型上皮细胞(4.8±1.2)×106,纯度达到(85.0±2.4)%,细胞活力为(92.0±2.4)%,倒置显微镜下原代肺泡Ⅱ型上皮细胞呈圆形或立方形,细胞质内有大量反差明显的细小颗粒,细胞为岛状生长方式;免疫细胞化学鉴定,肺泡表面活性蛋白A呈棕黄色,肺泡表面活性蛋白C呈绿色,均定位表达于细胞浆;透射电镜见特征性板层小体和细胞游离面大量微绒毛。证实利用胰酶联合胶原酶消化,差速离心差速贴壁和免疫黏附纯化的方法可获得高产量高纯度的AECⅡ,能满足一般的体外实验要求。

肺泡Ⅱ型上皮细胞的原代培养及生物学特性比较研究

目的:建立大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)的改良体外原代培养法,并对其生物学特性进行比较研究。方法:AECⅡ用胰蛋白酶和胶原酶消化法分离后,接种于大鼠免疫球蛋白G(IgG)包被的培养瓶黏附纯化。将获得的AECⅡ用碱性磷酸酶(AKP)、电镜和肺表面活性物质相关蛋白A(SPA)免疫细胞化学方法进行鉴定,并对它的SPA表达和转染特性与AECⅡ来源A549细胞进行比较研究。结果:胰蛋白酶和胶原酶消化加IgG黏附纯化后所得的AECⅡ,产量为2×107-3×107,纯度为75%-84%,细胞活力93%以上,AKP染色快捷简便。AECⅡ同A549细胞相比具有某些不同的特性。结论:采用IgG黏附纯化能提高AECⅡ纯度,AKP染色简便实用。对于AECⅡ细胞的某些特性研究发现其并不能完全用A549细胞系来代替。

脂多糖下调过氧化物酶增殖体激活受体γ在大鼠原代肺泡Ⅱ型上皮细胞的表达

目的观察脂多糖(lipopolysac charide,LPS)作用下大鼠肺泡Ⅱ型上皮(typeⅡalveol arepith elial,AT-Ⅱ)细胞过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)的表达变化情况。方法通过酶消化分离和免疫黏附法纯化原代培养AT-Ⅱ细胞,并进行碱性磷酸酶、肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)和电镜鉴定。采用RT-PCR法检测细胞经LPS作用后PPARγ、TNF-α、SP-AmRNA的改变,Westernblot法检测LPS作用后细胞PPARγ表达,ELISA法检测TNF-α蛋白表达。结果经碱性磷酸酶、SP-A和电镜鉴定,原代培养AT-Ⅱ细胞成功;在致炎因子LPS作用下,PPARγmRNA和蛋白表达均下降,这一变化伴随炎性因子TNF-α的升高。结论在LPS作用下,AT-Ⅱ细胞内PPARγ表达降低,提示PPARγ参与炎症反应。

肺泡Ⅱ型上皮细胞原代培养及高体积分数氧-停氧对其细胞内钙离子水平的影响

目的原代培养肺泡Ⅱ型上皮细胞（AEⅡ），并动态观察高体积分数氧（高氧）-停氧对其细胞内钙离子（[Ca^2＋]i）的影响，为体外研究AECⅡ及阐明高氧肺损伤发病机制提供实验基础。方法孕19d SD大鼠麻醉消毒后超净台内剖腹取出所有胎鼠。用胎鼠肺组织进行AECⅡ分离、纯化及原代培养，倒置相差显微镜下观察其细胞的形态及生长状况。通过激光共聚焦显微镜观察其肺表面活性蛋白C（SP—C）免疫荧光的阳性表达鉴定AECⅡ。鉴定为AECⅡ的细胞通以高氧（氧流量为3mL／min，测氧仪检测氧体积分数为930—970mL／L），持续约5min后立即停氧，用激光共聚焦显微镜动态观察[Ca^2＋]i的变化情况，记录其随时间改变的动态变化曲线，同时观察钙离子荧光强度的变化并连续拍摄照片。结果例置相差显微镜观察AECⅡ呈岛状分布，铺路石状，细胞核及核仁明显，胞核圆形，胞浆内较多颗粒。激光共聚焦显微镜下可见AECⅡ胞浆中呈现绿色荧光的SP—C阳性表达。予AECⅡ高氧刺激时，[Ca^2＋]i出现短暂下降后持续上升，上升至一定程度后又缓慢下降，甚至出现[Ca^2＋]i耗竭现象，并维持该水平。予停氧刺激，[Ca^2＋]i出现短暂下降后迅速上升，然后逐渐趋于平稳。随着[Ca^2＋]i水平的增减，Ca^2＋荧光强度相应的增强或减弱。结论高氧及给氧后停氧均可使[Ca^2＋]i产生明显变化，可能是高氧导致AECⅡ损伤的重要途径之一。

HO-1对原代培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的影响

目的 研究血红素加氧酶-1（HO-1）对原代培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（AEC-Ⅱ）生长的直接影响.方法 免疫黏附法纯化SD大鼠AEC-Ⅱ,细胞进行活性和纯度鉴定后,随机分为七组：A组（正常对照组）;B组（H2O2组,0.5 mmol/L H2O2）;C1～5组（0.01～50 μmol/L HO-1）.各组进行细胞形态学观察、细胞计数和以MTT法测定OD值.结果 ①免疫黏附法可收获AEC-Ⅱ（2～2.5）×107个/鼠,活性和纯度均＞90%;电镜下可见AEC-Ⅱ特征性结构--嗜锇性板层小体（Lb）.②B组培养AEC-Ⅱ至29 h,发现贴壁细胞数量减少,胞内可见反光增强的空泡,上清液中可见较多的细胞碎片.③C组与A组比较细胞计数、OD值差异无统计学意义（P＞0.05）,细胞形态无明显改变;与B组比较细胞计数、OD值差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 0.01～50 μmol/L HO-1对原代培养AEC-Ⅱ的生长没有直接的细胞毒性,可以在体外AEC-Ⅱ培养中使用.

纳米塑料诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞DNA损伤加重重症哮喘

目的·探讨纳米塑料(nanoplastics,NPs)对重症哮喘发生发展的影响及潜在分子机制。方法·建立屋尘螨(house dust mite,HDM)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)联合诱导的重症哮喘小鼠模型,并给予聚苯乙烯纳米塑料(polystyrene nanoplastics,PS-NPs)气道滴注,收集小鼠肺泡灌洗液及制作肺组织切片。通过流式细胞术、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,H-E)染色、过碘酸希夫(periodic acid-Schiff,PAS)染色、免疫组织化学染色、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)染色,观察PS-NPs对重症哮喘小鼠气道炎症、黏液分泌、肺泡结构,以及肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar typeⅡepithelial cells,AT2 cells)增殖和凋亡的影响。采用CCK-8法及AnnexinⅤ/PI双染色法测定PS-NPs对小鼠AT2细胞系MLE-12细胞增殖、凋亡的影响。使用γ-H2A.X免疫荧光染色检测PS-NPs对AT2细胞的DNA损伤作用。通过实时荧光定量聚合酶链反应(realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qPCR)、蛋白质印迹法(Western blotting)、酪胺信号放大(Tyramide signal amplification,TSA)多重荧光染色及免疫荧光共定位检测PS-NPs对AT2细胞ATR/Chk1/p53信号通路相关基因和蛋白表达的影响。使用ATR特异抑制剂Ceralasertib(AZD6738)与PS-NPs共同处理MLE-12细胞,以测定其对细胞增殖、凋亡的恢复作用。结果·流式细胞术显示,重症哮喘小鼠暴露于PS-NPs后,其肺泡灌洗液中炎症细胞总数及各炎症细胞数量均有增加,以中性粒细胞增多为主;肺组织H-E染色及PAS染色显示,气道炎症细胞浸润及气道黏液分泌显著增加,肺泡结构被破坏。在体外试验中,CCK-8结果显示PS-NPs显著抑制MLE-12细胞的增殖能力并呈现浓度依赖性;AnnexinⅤ/PI双染色结果显示,PS-NPs暴露后的细胞凋亡率[(56.20±3.84)%]相比于未暴露组[(23.22±2.52)%]显著上升;免疫荧光染色显示PS-NPs能被MLE-12细胞所吞噬并定位在细胞核周围。TUNEL染色结果表明,在体内PS-NPs同样促进AT2细胞凋亡的发生。免疫荧光染色结果显示,与对照组相比,实验组DNA损伤标志物γ-H2A.X表达增加。qPCR、Western blotting、TSA多重荧光染色显示,PS-NPs诱导MLE-12细胞ATR/Chk1/p53信号通路相关基因和蛋白表达水平升高。免疫荧光共定位实验也证实在小鼠体内,PS-NPs诱导AT2细胞表达ATR、p53蛋白。而ATR特异抑制剂Ceralasertib能部分恢复由PS-NPs引起的MLE-12细胞增殖的抑制和凋亡的增强。结论·NPs暴露能够造成AT2细胞DNA损伤,激活ATR/Chk1/p53信号通路,进而加重重症哮喘小鼠气道炎症反应及肺泡结构损伤。

松木屑烟雾溶液对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的研究

目的探讨不同浓度松木屑烟雾溶液对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar typeⅡepithelial cell,AT-Ⅱ)活性、细胞凋亡和炎性细胞因子表达的影响。方法将松木屑燃烧产生的烟雾通过负压排气法收集到二甲基亚砜溶液(dimethyl sulfoxide,DMSO)中并混匀(以下简称为烟雾溶液)。根据与AT-Ⅱ共培养的干预因素不同,分为正常组(AT-Ⅱ细胞未经任何处理)、对照组(细胞培养基中加入1.00‰DMSO)、低浓度致伤组(细胞培养基中加入0.50‰烟雾溶液)、中浓度致伤组(细胞培养基中加入0.75‰烟雾溶液)和高浓度致伤组(细胞培养基中加入1.00‰烟雾溶液),致伤后6、12、24和48 h,采用细胞计数试剂盒(cell counting kit 8,CCK-8)检测AT-Ⅱ活性,流式细胞术检测AT-Ⅱ凋亡情况,酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞匀浆上清液中白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)的含量。结果致伤后不同时间点、不同组别间细胞增殖、细胞凋亡变化差异均有统计学意义(P均<0.001),低、中、高浓度致伤组细胞增殖情况随着烟雾浓度的增加逐渐降低,细胞凋亡率随着烟雾浓度的增加逐渐升高(P均<0.05)。致伤后不同时间点、不同组别间细胞中IL-6、TNF-α水平差异均有统计学意义(P均<0.001),且烟雾浓度越高,细胞中IL-6、TNF-α水平越高。结论低、中、高浓度的松木屑烟雾溶液均可显著降低AT-Ⅱ增殖活性,促使细胞凋亡,增加IL-6和TNF-α的表达。

小鼠胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、原代培养及鉴定

目的:建立系统可靠的小鼠胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、培养、纯化及鉴定技术,为进一步研究肺纤维化及肺肿瘤等疾病的发病机制奠定基础.方法:应用低质量分数胰酶联合胶原酶的方法消化小鼠胎鼠肺组织块,经差速离心和差速贴壁的方法纯化肺泡Ⅱ型上皮,进行原代培养.用改良巴氏染色法和透射电镜观察对所分离的细胞进行鉴定.结果:每只胎鼠可获得(5±2)×106的细胞产量,细胞活力为95%±2%,纯度达到92%±2%,改良巴氏法镜下观察可见胞质内含较多深色颗粒,透射电镜观察到特征性的嗜锇小体即板层小体和细胞膜上有明显的微绒毛.结论:该方法能成功分离出小鼠胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞,且产量大、纯度高,能满足体外研究的需要.

人羊膜间充质干细胞对松木屑烟雾溶液染毒大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖、凋亡及炎症因子影响的研究

背景烟雾吸入性肺损伤在烧伤患者中较为常见,吸入的有毒气体、颗粒等易引起急性肺损伤(acute lung injury,ALI),目前无特异性治疗方法。目的研究人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)对松木屑烟雾溶液染毒大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar typeⅡepithelial cells,AT-Ⅱ)增殖、凋亡及炎症因子的影响。方法采用酶消化法分离培养hAMSCs和AT-Ⅱ,采用流式细胞术和免疫荧光分别鉴定hAMSCs和AT-Ⅱ;松木屑烟雾溶液染毒AT-Ⅱ复制烟雾诱导的细胞损伤。实验细胞分为对照组(无血清DMEM/F12)、致伤组(0.75‰松木屑烟雾溶液染毒)和治疗组(0.75‰松木屑烟雾溶液染毒,hAMSCs与AT-Ⅱ共培养)。采用CCK-8检测细胞的增殖活性;Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡;Elisa检测炎症因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6和IL-10的表达。结果与对照组比较,致伤组AT-Ⅱ的活性降低(P<0.01),经hAMSCs治疗后,与致伤组比较,AT-Ⅱ细胞活性增加(P<0.01);致伤组细胞的凋亡率在12 h和24 h均增加(P<0.01),hAMSCs治疗后细胞凋亡率降低(P<0.01);细胞致伤后炎症因子TNF-α、IL-6和IL-10的含量增加(P<0.05),经hAMSCs共培养12 h和24 h后,促炎因子TNF-α和IL-6的表达均下调(P<0.05),IL-10含量增加(P<0.05)。结论hAMSCs可以促进松木屑烟雾溶液诱导的AT-Ⅱ增殖和抑制细胞凋亡,可能与调节炎症因子的表达有关,为探究hAMSCs治疗烟雾引起的急性肺损伤提供理论依据。

Ⅱ型肺泡上皮细胞来源外泌体miR-21-5p靶向SKP2缓解支气管肺发育不良

目的探讨来源于Ⅱ型肺泡上皮细胞(typeⅡalveolar epithelial cells,AEC-Ⅱ)外泌体(exosomal,Exos)-miR-21-5p(简称miR-21)靶向S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase associated protein 2,SKP2)对支气管肺泡发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)的保护效应及作用机制。方法使用60只6~8周龄的SD大鼠,其中30只通过差速贴壁离心法提取原代AEC-Ⅱ并进行培养。密度梯度离心法用于获得AEC-Ⅱ来源的外泌体,密度梯度离心法用于提取AEC-Ⅱ培养基中囊泡,并通过透射电镜及粒径分析对其验证,双荧光素报告基因实验以确认miR-21与SKP2的靶向关系。剩余的30只大鼠按照3∶1的雌雄比例混合,以便于进行怀孕检测。将这些新生小鼠随机分为4个不同的实验组:空气对照组(Con组)、高氧处理组(BPD+PBS组)、接受高氧和外泌体治疗的小鼠(BPD+Exos-miR-21组),以及高氧联合外泌体miR-21抑制剂处理组(BPD+Exos-AV-miR-21组)。新生SD大鼠将暴露于85%的氧气环境中,以此建立BPD模型。经过14 d高氧处理后,使用RTq-PCR技术检测肺组织和外泌体中miR-21的表达水平。肺组织经HE染色观察其病理学变化,并计算了平均肺泡线性截距(MLI)和放射状肺泡计数(RAC)。分光光度法测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-AOC)的水平,荧光分光光度法测定活性氧簇(ROS)水平。此外,利用Western blot技术检测了SKP2、NR2F2和VEGF-A蛋白的表达水平。结果电镜及粒径分析结果显示AEC-Ⅱ细胞提取的小泡结构物质属于外泌体,miR-21在外泌体中表达显著上调(P<0.01),双荧光素酶基因报告实验证实SKP2为miR-21的作用靶标。与Con组比较,BPD+PBS组及BPD+Exos-AVmiR-21组肺组织HE可见肺组织结构紊乱,肺泡增大、简化,ROS、MDA、MLI增高及SKP2蛋白表达升高(P<0.01);而RAC、SOD、T-AOC、miR-21下调及NR2F2、VEGF-A蛋白表达降低(P<0.01);与BPD+PBS组比较,BPD+Exos-miR-21组肺组织HE可见无肺泡数目增加,肺泡简化程度好转,同时MLI、ROS、MDA降低及SKP2蛋白表达降低(P<0.01);而ROC、SOD、T-AOC、miR-21上调及NR2F2、VEGF-A蛋白表达升高(P<0.01)。结论AEC-Ⅱ来源的Exos-miR-21可能靶向SKP2通过促进NR2F2、VEGF-A蛋白表达抑制氧化应激促进肺泡发育改善BPD。

膜联蛋白A1拟肽AC2-26调控ERK/NF-κB信号通路改善体外循环血清诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤

目的探究AC2-26对体外循环(CPB)血清诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的影响及其作用机制。方法收集16例风湿性心脏病手术患者CPB停机后的无菌血液并分离血清,建立体外循环血清诱导大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤模型。提取健康SD大鼠原代肺泡Ⅱ型上皮细胞,培养72 h后,随机分为5组即对照组(C组),肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)损伤组(M组),AC2-26+AECⅡ损伤组(A组),AECⅡ损伤+Boc2组(B组),AC2-26+AECⅡ损伤+Boc2组(A+B组)。CCK-8、流式细胞术检测各组细胞增殖、凋亡情况;免疫荧光检测各组肺泡Ⅱ型上皮细胞甲酰肽受体2(FPR2)和肺泡表明活性物质(SPC)表达情况;透射电镜观察肺泡Ⅱ型上皮细胞板层小体的影响;Western blot检测各组肺泡Ⅱ型上皮细胞ERK、NF-κB表达情况。结果应用AC2-26后,CPB血清诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖率明显升高,凋亡率明显降低(P<0.05),AC2-26明显抑制ERK及NF-κB蛋白的磷酸化(P<0.05),促进SPC的表达,改善细胞内板层小体结构及形态,这一现象可被甲酰肽受体抑制剂Boc2阻断。结论AC2-26可以减轻CPB血清诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤,其作用机制可能与FPR2调节ERK、NF-κB信号通路有关。

重症急性胰腺炎肺损伤发病机制中的肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的作用及乌司他丁干预的实验研究

目的探讨重症急性胰腺炎(SAP)发病机制中其肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的作用并对乌司他丁对其干预的作用进行分析。方法将42只健康大鼠随机分为3组,分别为假手术组、模型组与乌司他丁干预组,每组14只,以向大鼠十二指肠乳头内侧胰胆管注射脱氧胆酸钠建立SAP大鼠模型,假手术组大鼠仅打开大鼠腹腔轻轻翻动其胰腺后关闭腹腔,乌司他丁干预组于大鼠建模后给予乌司他丁注射。对几组大鼠术后肺组织及胰腺组织的病理变化及相关指标差异进行分析。结果与假手术组比较,SAP组及乌司他丁干预组TNF⁃α、AMY及MDA水平明显更高,乌司他丁干预组与SAP组比较,TNF⁃α、AMY及MDA水平明显更低(P<0.05)。SAP大鼠伴随着明显的肺损伤状况,假手术组、SAP组、乌司他丁干预组肺湿/干比值分别为3.62±0.56、6.48±0.77、4.69±0.63,血气指标PaCO_(2)、PaO_(2)分别为(31.25±1.03)mmHg、(106.52±2.03)mmHg,(48.67±2.01)mmHg、(73.57±2.44)mmHg和(35.22±1.32)mmHg、(90.22±3.01)mmHg),SAP组及乌司他丁干预组大鼠肺湿/干比值及PaCO_(2)明显上升,PaO_(2)明显下降,相较于SAP组,乌司他丁干预组大鼠的肺湿/干比值及PaCO_(2)更低,PaO_(2)更高(P<0.05)。假手术组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率[(3.58±0.57)%]及Ca^(2+)浓度[(34.52±2.35)%]均显著低于SAP组凋亡率[(29.67±4.52)%]及Ca^(2+)浓度[(82.66±4.66)%]及乌司他丁干预组凋亡率[(14.62±3.67)%]及Ca^(2+)浓度[(46.77±5.02)%],乌司他丁干预组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率及Ca^(2+)浓度显著低于SAP组(P<0.05)。假手术组大鼠Caspasee⁃8、BaxmRNA表达均显著低于SAP组及乌司他丁干预组,乌司他丁干预组大鼠Caspasee⁃8、BaxmRNA表达显著低于SAP组(P<0.05)。SAP肺损伤大鼠线粒体细胞破坏明显,乌司他丁对减少线粒体细胞破坏数量具有明显作用。结论SAP肺损伤中肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡可能参与了其作用机制,TNF⁃α、AMY、MDA、Caspasee⁃8、BaxmRNA在肺损伤机制中存在重要作用,乌司他丁干预有利于缓解SAP肺损伤状况,有利于控制病情进展。

右美托咪定通过调控白细胞介素-17及转化生长因子-β1/Smad蛋白3信号通路对脂多糖诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的影响

目的探讨右美托咪定介导白细胞介素(IL)-17对脂多糖(LPS)诱导的人Ⅱ型肺泡上皮A549细胞(以下简称“A549细胞”)炎症、增殖、迁移、上皮间质转化及转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad蛋白3(Smad3)信号通路的调控作用。方法体外培养A549细胞,将其分为对照组(不做干预)、LPS组(10.00μg/ml LPS)和实验组(10.00μg/ml LPS+1.25、2.50、5.00、10.00μg/ml右美托咪定),分别采用CCK-8试剂盒和反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)法测定细胞活力和IL-17 mRNA表达水平以筛选右美托咪定最适实验浓度;随后将细胞分为对照组、LPS组、IL-17组、右美托咪定组和IL-17+右美托咪定组,干预24 h。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测炎症因子IL-17、IL-8和IL-6的表达水平;5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(EdU)试剂盒用来检测细胞增殖率;划痕实验用来检测细胞迁移率;蛋白免疫印迹(WB)法测定肺泡上皮间质转化(EMT)相关蛋白、TGF-β1/Smad3通路相关蛋白及IL-17蛋白表达水平。结果右美托咪定逆转了LPS对A549细胞活力的抑制作用和IL-17 mRNA表达水平的促进作用,且10.00μg/ml浓度的右美托咪定组的效果最好,因此选择10.00μg/ml右美托咪定用于后续实验。LPS组细胞中IL-17、IL-8、IL-6表达水平、细胞迁移率、N-钙黏蛋白、波形蛋白、纤维粘连蛋白(FN)、Smad3的磷酸化(p-Smad3)/Smad3、TGF-β1和IL-17蛋白表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);LPS组细胞增殖率、E-钙黏蛋白和Smad7蛋白表达水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。IL-17+右美托咪定组IL-17、IL-8、IL-6表达水平、细胞迁移率、N-钙黏蛋白、波形蛋白、FN、p-Smad3/Smad3、TGF-β1和IL-17蛋白表达水平低于LPS组,差异有统计学意义(P<0.05);IL-17+右美托咪定组细胞增殖率、E-钙黏蛋白和Smad7蛋白表达水平高于LPS组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论右美托咪定通过抑制IL-17的分泌恢复LPS诱导的人Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤,促进LPS诱导的人Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖并抑制其迁移和EMT进程,其作用机制与抑制TGF-β1/Smad3通路的信号转导有关。