视黄醇结合蛋白1通过激活TAK1促进大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大

目的:探究视黄醇结合蛋白1(retinol binding protein 1, Rbp1)在大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大中的功能和机制。方法:本研究通过联合分析基因表达数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)中的小鼠心肌肥厚基因芯片数据,寻找在心肌肥厚发生过程中的关键调控因子,构建该基因过表达及敲减腺病毒并感染大鼠乳鼠原代心肌细胞,利用血管紧张素II(angiotensin II, Ang II)诱导大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大模型,研究目的基因对大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大的影响,应用Western blot及RT-qPCR探究目的基因调控大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大的分子机制。结果:在小鼠心肌肥厚心脏组织中Rbp1的表达显著上调(P<0.01),体外细胞实验显示与对照组相比,Rbp1过表达组的大鼠乳鼠原代心肌细胞面积显著增大,心肌肥厚标志基因心钠肽(atrial natriuretic peptide, Anp)和肌球蛋白重链7(myosin heavy chain 7, Myh7)的表达显著升高(P<0.01),证实Rbp1过表达能促进Ang II诱导的大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大;相反,Rbp1敲减则能显著抑制Ang II诱导的大鼠乳鼠原代心肌细胞面积增加和心肌肥厚标志物表达。机制研究显示,Rbp1过表达显著激活转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1, TAK1)和P38(P<0.01),应用TAK1抑制剂可阻断Rbp1过表达对Ang II诱导大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大的促进作用。结论:Rbp1可通过激活TAK1信号通路促进Ang II诱导的大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大。

QCM监测不同浓度肌力药物作用下乳鼠原代心肌细胞的粘弹性响应

采用石英晶体微天平(QCM)非侵入式实时监测乳鼠原代心肌细胞于金晶体电极上的动态黏附响应与不同浓度肌力药物下的粘弹性响应。在乳鼠原代心肌细胞黏附铺展于金晶体电极表面后,加入不同浓度的正性肌力药物异丙肾上腺素与负性肌力药物维拉帕米,监测QCM频率(F)以及动态电阻(R)的实时变化,采用粘弹性指数CVI(CVI=ΔR/ΔF)表征细胞的粘弹性变化,并通过光学显微镜观察药物作用下细胞的形态变化。结果表明:随着异丙肾上腺素浓度的增加,药物引起的QCM频率下降、电阻增加与CVI增大的幅度均增大;光学显微镜下观测到细胞收缩,符合CVI变大、细胞变硬的响应;随着维拉帕米浓度的增加,药物引起的QCM频率升高、电阻下降与CVI减小的幅度均增大;光学显微镜下观测到细胞舒张,符合CVI变小、细胞变软的响应。说明QCM与原代心肌细胞结合作为心血管药物筛选细胞模型与工具有很大的应用前景。

激活Sonic hedgehog通路改善缺血缺氧心肌细胞DNA损伤

目的探究Sonic hedgehog通路在糖氧剥夺(oxygen and glucose deprivation,OGD)诱导的乳鼠心肌细胞DNA损伤和细胞凋亡中的作用及机制。方法原代培养乳鼠心肌细胞,建立OGD的缺血缺氧模型,分别给予Sonic hedgehog通路激动剂SAG1.3(0.002μmol·L^(-1))、抑制剂GANT61(0.005μmol·L^(-1))处理6、12 h,MTT法检测细胞生存率;Western blot检测DNA损伤标志物γH2AX、DNA损伤反应蛋白ATM、ATR,以及细胞凋亡相关蛋白p53、凋亡标志物cleaved-caspase-3、Bcl-2、Bax表达;免疫荧光检测γH2AX表达。结果与正常组相比,OGD组心肌细胞γH2AX、p-ATM表达呈时间依赖性增加,OGD 6 h达到高峰,OGD 12 h后表达逐渐下降;p-p53、cleaved-caspase-3表达增加,Bcl-2/Bax比例下降;与OGD 6 h、OGD 12 h组相比,给予SAG1.3组OGD心肌细胞γH2AX、p-ATM表达明显下降,心肌细胞存活率上升,p-p53、cleaved-caspase-3表达下降,Bcl-2/Bax比例上升;GANT61组OGD心肌细胞较OGD组γH2AX、p-ATM表达明显上升,细胞存活率下降,p-p53、cleaved-caspase-3表达上升,Bcl-2/Bax比例下降。结论激活Sonic hedgehog通路可以通过抑制ATM磷酸化,减少γH2AX表达,改善缺血缺氧诱导的心肌细胞DNA损伤,抑制细胞凋亡。

枳实薤白桂枝汤抗心肌细胞损伤活性成分的发现研究

用H2O2损伤乳鼠心肌细胞,并用二乙酸荧光素(fluorescein diacetate,FDA)标记活细胞,建立心肌细胞损伤模型用于心肌细胞保护物质的筛选;以抗坏血酸(Vc)为阳性对照,对枳实薤白桂枝汤的43个组分进行快速筛选,发现了7个心肌细胞保护作用较明显的组分;采用液相色谱-质谱联用法(LC-MS)对C18,D14,D15,D16和E09进行定性分析,推测出11个化学成分;对其中6个成分进行快速筛选,发现橙皮苷、新橙皮苷和圣草酚具有心肌细胞保护作用,而圣草酚的活性最强,且呈良好的量效关系。

体外筛选川芎治疗冠心病的有效成分的提取纯化工艺研究

目的:通过体外筛选方法,优选川芎治疗冠心病的有效成分的提取纯化工艺。方法:培养原代乳鼠心肌细胞,利用连二亚硫酸钠(Na2S2O4)缺氧1 h复氧1 h,损伤心肌细胞制备心肌细胞缺氧-复氧损伤模型来模拟体内缺血再灌注损伤,通过体外筛选方法,优选出川芎治疗冠心病的有效成分的最佳提取和纯化工艺。结果:优选出川芎的最佳提取工艺为使用6倍量的水,提取2次,每次1 h;其纯化工艺为使用15 ml HPD-300树脂,取9 BV的0.5 g/ml的川芎提取液上样,以5 BV的50%醇洗脱。结论:通过体外筛选的提取纯化工艺可信度高,为开发研究心脑血管疾病的药物提供了依据。