人原代呼吸道上皮细胞培养及抗呼吸道合胞病毒活性

为建立人原代呼吸道上皮细胞(Human airway epithelial cell,hAEC)的培养方法,并在hAEC体系上探讨3-硫代吲哚类化合物RSV-A-4和免疫抑制剂代谢产物6-MMPr的抗呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)活性及其机制,从而构建可用于RSV药物筛选及药效评价的细胞模型。采集人呼吸道上皮细胞样本,分离细胞后建立hAEC的培养方法,并进行细胞形态和活力鉴定;在hAEC体系上检测小分子化合物RSV-A-4和6-MMPr的抗RSV活性及其细胞毒性;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)与Time-of-addition assay技术,探讨RSV-A-4和6-MMPr的抑制RSV复制的作用机制。培养的hAEC经鉴定:其体外培养存活率可达93.51%;RSV-A-4和6-MMPr的半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC_(50))分别为(207.30±4.77)μmol/L和(3191.00±6.11)μmol/L,6-MMPr的半数细胞毒性浓度(Half maximal cytotoxic concentration,CC_(50))为(95526.00±10.97)μmol/L,而RSV-A-4对hAEC未见明显细胞毒性;RSV-A-4和6-MMPr均在RSV病毒基因组复制阶段抑制RSV复制。成功建立可用于抗RSV药物筛选及体外评价的hAEC培养体系,RSV-A-4和6-MMPr在细胞水平均能有效抑制RSV复制。

甘草酸抑制呼吸道合胞病毒感染支气管上皮细胞凋亡的机制研究

目的:探讨甘草酸对呼吸道合胞病毒(RSV)感染的支气管上皮细胞凋亡的影响,分析其机制是否与内源性酪氨酸激酶2(JAK2)/信号传导和转录激活因子3(STAT3)信号通路有关。方法:将HBE细胞分为对照组、感染组(RSV组)、低剂量甘草酸组(RSV+L-甘草酸组)、中剂量甘草酸组(RSV+M-甘草酸组)、高剂量甘草酸组(RSV+H-甘草酸组)、RSV+Colivelin组、RSV+H-甘草酸+SD-1029组。对照组细胞不经任何处理;RSV组用含0.0001 PFU/mL的RSV病毒溶液培养细胞2h,再更换为正常培养液培养24h;RSV+L-甘草酸组、RSV+M-甘草酸组和RSV+H-甘草酸组在RSV感染HBE细胞模型的基础上,用30、60、120μg/mL甘草酸处理的培养基培养的细胞;RSV+Colivelin组在RSV感染HBE细胞模型的基础上,用含有浓度为0.5μmoL/L JAK2/STAT3信号通路激活剂Colivelin处理的培养基培养细胞;RSV+H-甘草酸+SD-1029组在RSV感染HBE细胞模型的基础上,用120μg/mL甘草酸和10μmoL/L JAK2/STAT3信号通路抑制剂SD-1029共同处理的培养基培养细胞。24h后收集细胞,CCK-8试剂盒检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞凋亡;ELISA检测细胞上清液中IL-6、TNF-α水平;western blot检测细胞中Bax、cleaved-Caspase-3、Bcl-2、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3蛋白表达情况。结果:与对照组比较,RSV组OD值、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达均显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、IL-6、TNF-α水平、Bax蛋白表达量显著升高(P<0.05);与RSV组比较,RSV+L-甘草酸组、RSV+M-甘草酸组、RSV+H-甘草酸组、RSV+Colivelin组OD值、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达均显著升高(P<0.05),细胞凋亡率、IL-6、TNF-α水平、Bax蛋白表达量显著降低(P<0.05);与RSV+H-甘草酸组比较,RSV+H-甘草酸+SD-1029组OD值、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达均显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、IL-6、TNF-α水平、Bax蛋白表达量显著升高(P<0.05)。结论:甘草酸可能通过激活JAK2/STAT3信号通路,促进RSV感染的支气管上皮细胞增殖,抑制RSV感染的支气管上皮细胞的凋亡。

LncRNA XIST调节miR-574-5p/TLR4轴对呼吸道合胞病毒感染的支气管上皮细胞凋亡的影响

目的探讨长链非编码(long non-coding,Lnc)核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)X-非活性特异性转录本(X-inactive specific transcript,XIST)调节微小RNA(microRNA,miR)-574-5p/Toll样受体(Toll-like receptor 4,TLR4)轴对呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染的支气管上皮细胞凋亡的影响。方法将人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial,16HBE)分为阴性对照(negative control,NC)组、RSV感染(RSV infection,RSV)组、小干扰RNA阴性对照(small interfering RNA negative control,si-NC)组、XIST小干扰RNA(XIST small interfering RNA,si-XIST)组、siXIST+抑制剂阴性对照(inhibitor negative control,inhibitor-NC)组、si-XIST+miR-574-5p抑制剂(miR-574-5p inhibitor)组,实时荧光定量聚合酶链反应检测LncRNA XIST、miR-574-5p表达;5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)染色、流式细胞术分别检测细胞增殖、凋亡;酶联免疫吸附试验检测肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β的分泌;双荧光素酶报告基因实验验证miR-574-5p与LncRNA XIST和TLR4的关系;蛋白质印迹检测TLR4、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、细胞抗凋亡因子B淋巴细胞瘤-2(B lymphoblastoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved cysteine aspartate proteolytic enzyme 3,Cleaved Caspase-3)蛋白表达。结果相较于NC组,RSV组、si-NC组LncRNA XIST、凋亡率、IL-6、IL-1β、TNF-α水平、TLR4、Bax、Cleaved Caspase-3表达升高,EdU阳性率、miR-574-5p、PCNA、Bcl-2表达降低(P均<0.05);相较于si-NC组,si-XIST组LncRNA XIST表达、凋亡率、IL-6、IL-1β、TNF-α水平、TLR4、Bax、Cleaved Caspase-3表达降低,EdU阳性率、miR-574-5p、PCNA、Bcl-2表达升高(P均<0.05);下调miR-574-5p可逆转敲低LncRNA XIST对RSV感染的16HBE细胞凋亡和炎症反应的抑制(P<0.05);双荧光素酶报告基因实验证实miR-574-5p与LncRNA XIST、miR-574-5p与TLR4存在靶向调控关系(P<0.05)。结论LncRNA XIST在RSV感染的16HBE细胞中上调表达,敲低LncRNA XIST可能通过上调miR-574-5p来下调TLR4表达,抑制RSV感染后的16HBE细胞凋亡。

呼吸道合胞病毒对上呼吸道感染儿童呼吸道上皮细胞自噬和mTOR信号通路基因的影响

目的 探讨呼吸道合胞病毒(RSV)对上呼吸道感染儿童呼吸道上皮细胞自噬和mTOR信号通路相关基因的影响。方法 选择2022年11月至2023年12月唐山职业技术学院附属医院收治的145例上呼吸道感染儿童为研究对象,同时纳入同期体检的年龄和性别匹配的健康儿童(n=10)为健康对照组。采集所有儿童鼻咽分泌物标本(NPA),利用RT-PCR进行RSV筛查,通过G(黏附)基因扩增测定RSV毒株的分子特征并进行系统发育分析。利用qRT-PCR检测25例RSV阳性NPA样本(RSV组)和10例健康对照NPA样本(健康对照组)的呼吸道上皮细胞自噬相关基因(BECN1、ATG3、ATG5、NPC1与GABARAP)和mTOR信号通路相关基因(AKT1、mTOR、PDPK1、RICTOR与TSC1)的表达水平。结果 在145份上呼吸道感染儿童NPA样本中,69份(47.6%)为RSV阳性。对31株有代表性的RSV进行循环基因型检测,经BLAST分析,31株RSV均为RSV-A型。通过靶向G基因的胞外域部分,系统发育分析发现31株RSV-A聚类为具有72 bp核苷酸重复的ON1基因型。此外,毒株分别属于谱系1(51.6%),其次是谱系3(29%)和谱系2(19.4%)。RSV组呼吸道上皮细胞中ATG3和NPC1 mRNA表达水平显著高于健康对照组(均P<0.001)。RSV组呼吸道上皮细胞中AKT1、mTOR和TSC1 mRNA表达水平显著低于健康对照组(均P<0.001)。结论 RSV感染可以提高上呼吸道感染儿童呼吸道上皮细胞中自噬相关基因(ATG3和NPC1)的表达,抑制mTOR信号通路相关基因(AKT1、mTOR和TSC1)的表达,进而逃避宿主免疫系统,以实现其在宿主内的生存方式。

应用原代人呼吸道上皮细胞（HAE）分离鉴定陈旧性呼吸道样本中流感病毒

目的 采用分化良好的原代人呼吸道上皮细胞（HAE）对陈旧性呼吸道样本中流感病毒H3N2分离并与MDCK细胞进行比较.方法 选择青海地区1株2010年因不明原因肺炎采集的鼻咽拭子标本,经检测流感核酸弱阳性,血凝阴性.分别接种等量的呼吸道样本于HAE和MDCK细胞并进行传代,观察细胞病变,电镜观察病毒形态,测定全基因组序列,同时测定血凝活性.结果 MDCK细胞无法分离获得病毒,但HAE可成功分离病毒：盲传3代后,可观察明显细胞病变;电镜下为典型的流感病毒形态;流感血凝抑制活性1∶16;经病毒基因组序列测定确定为近年来流行的季节性流感病毒H3N2,命名A/Qinghai/178/2010（H3N2）,其序列与南京2010年流行株A/Nanjing/1655/2010（H3N2）亲缘关系最近.结论 HAE可应用于陈旧性呼吸道样本的病毒分离鉴定,用于流感病毒分离比MDCK细胞更灵敏.

花鲈肠上皮细胞原代培养及鉴定方法的探讨研究

为探究建立稳定可靠的花鲈肠上皮细胞原代培养方法,通过组织块法和酶消化法培养花鲈肠上皮细胞,确定酶消化法的最佳消化液及消化时间,所得细胞悬液于L-15培养液中进行培养。利用形态学观察、透射电镜观察和碱性磷酸酶染色方法对细胞进行鉴定。结果显示:组织块法细胞迁出情况不稳定,且迁出时间较长;酶消化法的最佳消化液为胶原酶Ⅰ、Ⅳ联合消化液,最佳消化时间为45 min;胶原酶Ⅰ、Ⅳ联合消化法获得的细胞连接紧密、排列整齐、呈上皮细胞典型的“铺路石”状,细胞相对独立、界限清晰。透射电镜观察和碱性磷酸酶染色进一步证实所培养的细胞为肠上皮细胞。总之,经胶原酶Ⅰ、Ⅳ联合消化液消化45 min、培养48 h可得到初始条件一致、生长旺盛的花鲈原代肠上皮细胞。

糖尿病肾病大鼠原代肾小管上皮细胞的提取及体外培养

目的探讨糖尿病肾病(DN)大鼠原代肾小管上皮细胞(RTECs)的提取及体外培养方法。方法取SD雄性大鼠25只,随机分为正常组(n=5)和模型组(n=20)。对模型组大鼠构建DN大鼠模型,不给予正常组任何处理。获取两组大鼠双肾组织,一部分组织用于HE染色及Masson染色以观察肾组织结构,另一部分用于RTECs的提取及培养。RTECs的提取、培养方法:将肾皮质组织在80目筛网上研磨,经100目筛网过滤、Ⅰ型胶原酶消化25 min后,使用含10%胎牛血清、1%胰岛素⁃转铁蛋白⁃硒⁃乙醇胺添加剂和1%青链霉素双抗溶液的DMEM/F-12完全培养基培养细胞。用免疫荧光染色法检测细胞角蛋白18的表达情况以鉴定所获得的细胞。结果(1)建模后模型组大鼠出现多饮、多食、多尿、体重下降、血糖升高等特征,尿蛋白定性呈阳性,肾组织病理检测提示肾小球结构不完整且出现明显缺损,RTECs明显肿胀、变性,肾小管管腔萎缩,肾小管间质纤维化严重。(2)培养72 h后,两组RTECs均已经贴壁并呈岛屿状聚集生长,培养5~8 d后细胞呈多边鹅卵石样。模型组RTECs高表达细胞角蛋白18,阳性率>95%。结论采用在80目筛网上研磨、100目筛网过滤、Ⅰ型胶原酶消化25 min的方法可以得到数量较多、活性良好、纯度较高的DN大鼠模型RTECs,且在形态与贴壁情况方面与正常大鼠RTECs无明显差异。

副猪格拉瑟菌5型细胞致死性膨胀毒素CdtB破坏猪呼吸道上皮屏障的机制

旨在探究副猪格拉瑟菌(Glaesserella parasuis,GPS)突破猪呼吸道上皮屏障引起系统性感染的机制。通过超速离心和密度梯度离心提取副猪格拉瑟菌外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs),OMVs经SDS-PAGE显示,蛋白质条带分布在55~100 ku,经透射电子显微镜(TEM)观察,OMVs的粒径在100~200 nm,纳米粒子直径分析(NTA)结果显示,样品在100~200 nm处的粒子数目最多。进而用制备的HbpA及OmpP2多克隆抗体对OMVs及不含OMVs的细菌上清进行Western blot验证,证实所提取的样品为外膜囊泡,且进一步结果证明细胞致死性膨胀毒素(CDT)在GPS培养物中主要以OMVs的形式存在。用OMVs或CdtB处理猪气管上皮细胞(swine tracheal epithelial cells, STEC)36 h,检测STEC中cleaved-caspase3、ZO-1和Occludin的蛋白表达水平,并用FITC-葡聚糖(FD-4)检测STEC单层细胞的细胞旁通透性。结果发现,OMVs与CdtB处理后凋亡相关蛋白cleaved-caspase3表达水平升高,ZO-1和Occludin的表达水平降低,FD-4渗透率升高,同时,乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试验发现,当CdtB与STEC单层细胞共孵育24 h、OMVs与STEC单层细胞共孵育36 h后,STEC存活率显著降低。而Pifithrin-α预处理STEC可抑制OMVs和CdtB引起的细胞凋亡和屏障通透性的增加。另外,用免疫磁珠捕获的方法去除OMVs中的CdtB(OMVs-ΔCdtB),OMVs-ΔCdtB处理STEC 36 h后cleaved-caspase3、ZO-1、Occludin表达水平与对照组相比无显著差异。综上,成功提取并纯化GPS OMVs,且试验证明GPS可通过OMVs转运CdtB诱导STEC凋亡和屏障损伤,为副猪格拉瑟菌突破呼吸道上皮屏障的机制提供新思路。

呼吸道合胞病毒感染对慢性鼻窦炎伴鼻息肉上皮屏障功能的影响

目的为探索呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染对慢性鼻窦炎伴鼻息肉(CRSwNP)和对照黏膜来源的人鼻黏膜上皮细胞(human nasal epithelial cells,hNECs)物理屏障关键分子的影响。方法不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)(0.1和0.3)的RSV分别感染鼻息肉(n=21)和对照黏膜(n=9)的hNECs 24 h和48 h后,提取总RNA,逆转录成cDNA后,采用实时荧光定量PCR检测ZO-1、ZO-2、Claudin-1、Claudin-4、Occludin、E-cadherin和N-cadherin的基因表达变化。结果RSV感染hNECs后,ZO-1、ZO-2、Claudin-1、Claudin-4、Occludin、E-cadherin和N-cadherin的基因表达水平均下降,但只在鼻息肉来源的hNECs中存在统计学差异(P<0.05)。RSV感染嗜酸性粒细胞型CRSwNP(eosinophilic CRSwNP,ECRSwNP)与非嗜酸性粒细胞型CRSwNP(nonECRSwNP)的hNECs相比,无显著差异。结论RSV感染可破坏鼻黏膜上皮屏障,与对照组相比CRSwNP组受RSV感染影响更重,且ECRSwNP组与nonECRSwNP组无显著差异。

呼吸道合胞病毒对大鼠原代气道上皮细胞表达胸腺基质淋巴细胞生成素的影响

目的:探讨分离和培养大鼠原代气道上皮细胞(primary rat airway epithelial cell,PRAEC)的方法,研究呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)对PRAEC表达胸腺基质淋巴细胞生成素(thymicstromal lymphopoietin,TSLP)的影响。方法:采用改良的酶消化法分离PRAEC,并在专用的支气管上皮培养基中培养。在培养成功的原代细胞中加入RSV以感染PRAEC。应用Real-time PCR检测正常的和受到RSV感染的PRAEC中TSLP基因表达。结果:获得纯度较高(约为97%)的PRAEC,细胞成活率为90%,获得细胞量为(1.02±0.33)×106个细胞/鼠,且存活时间较长。正常PRAEC表达少量的TSLP,但是在受到RSV感染后其TSLP表达出现增高,且TSLP的表达在一定范围内与RSV的滴度成正相关。结论:本实验成功地分离并培养了PRAEC,在此基础上进行的实验证实了RSV感染确实能够促进气道上皮细胞表达TSLP,为进一步研究RSV感染在哮喘发病中的作用机制奠定了基础。

小鼠呼吸道原代上皮细胞分泌三磷酸腺苷的特征研究

目的研究呼吸道上皮细胞分泌的三磷酸腺苷(ATP)与呼吸道清除功能密切相关,建立小动物呼吸道上皮原代细胞培养方法,比较分析其分泌ATP的特征。方法采用酶消化法制备小鼠支气管呼吸道上皮原代细胞,在低渗液刺激后的不同时间,用生化方法直接测定培养液上清中ATP含量。结果培养的呼吸道原代细胞可传代10代以上。原代细胞在低渗处理后,可快速产生ATP,其最大分泌量略低于正常人肺上皮细胞系,但产生速度较快。此方法建立的细胞对低渗刺激具有更真实的反应性,可用于上皮细胞的功能研究。结论原代呼吸道上皮细胞具有产生ATP的能力,其特征与上皮细胞系和原代平滑肌细胞产生ATP的特征有所不同。气道上皮和平滑肌细胞可同时产生ATP,有助于协同排除异物和病原体。

原代人呼吸道上皮细胞培养体系（HAE）及其在病毒学研究中的应用

分化良好的原代人呼吸道上皮细胞培养体系（HAE），是新近发展起来的呼吸道上皮组织体外重构技术。目前，该技术在国际上被广泛应用于病毒学的研究。本文将聚焦于HAE体系及其在呼吸道病毒研究中的应用，从呼吸道上皮的生理结构、固有免疫系统、体外重构方法以及HAE在呼吸道病毒研究中的应用等几个方面进行简要介绍以及系统的总结及展望。

猪呼吸道上皮细胞的体外原代培养研究

为探索猪呼吸道上皮细胞体外的原代培养,对胶原酶Ⅳ+胰酶消化法、胰酶消化法、胶原酶Ⅳ和胰酶消化结合组织块培养法以及组织块培养法等4种分离细胞的方法进行了比较,同时比较了不同浓度胎牛血清的培养基所培养细胞的纯度及成活率,采用差速贴壁法纯化细胞并对所得的上皮细胞进行冻存复苏研究。结果表明:组织块培养法培养获得的细胞数量和纯度极显著高于胰酶消化法(P<0.01),胶原酶Ⅳ+胰酶消化法获得的细胞成活率显著高于胰酶消化法;含有5%血清的培养基培养的细胞成活率及纯度均高于用10%血清培养(P<0.01),冻存1个月后的细胞复苏率为85%。

呼吸道合胞病毒感染支气管上皮细胞介导IL-8致Th17/Treg失衡

目的:探讨呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染导致哮喘易感性增加的机制,观察人支气管上皮细胞感染RSV后IL-8的表达,以及IL-8对Th17/调节性T淋巴细胞(regulatory T cells,Treg)分化的调节作用。方法:将人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBECs)分为对照组和RSV感染组,构建并验证RSV持续感染HBECs模型,real-time PCR检测对照组和RSV感染组中IL-8 m RNA的表达;ELISA检测感染细胞上清液中IL-8的浓度。提取健康人外周血淋巴细胞并将其分为空白对照组和IL-8作用组,参照ELISA检测到的浓度将IL-8作用于淋巴细胞24 h,采用流式细胞仪检测淋巴细胞中Th17和Treg亚群的分布情况。结果:本实验成功构建RSV持续感染HBECs模型,感染后的细胞仍能够继续分裂传代,并可检测到RSV持续存在的证据。免疫荧光显示细胞内有RSV致病蛋白的荧光表达;电镜下观察到感染细胞的线粒体水肿和内质网扩张,出现核周裂隙以及合胞现象,细胞核、胞浆内有病毒颗粒分布。Real-time PCR和ELISA分别检测到RSV感染组细胞内IL-8 m RNA表达和上清液中IL-8的分泌水平均高于对照组(均P<0.05)。进一步将IL-8作用于淋巴细胞,流式细胞学结果表明IL-8作用组淋巴细胞中Th17亚群比率增高(P<0.05),但Treg亚群比率与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:RSV感染气道上皮细胞后可通过过度分泌IL-8而引起Th 17/Treg亚群分化异常。

基于人呼吸道上皮细胞炎症模型的连翘提取物抗炎活性实验研究

通过复制LPS诱导的BEAS-2B炎症模型，探讨连翘提取物对炎症反应中炎性因子分泌的作用。采用MTT法检测BEAS-2B细胞活力，筛选连翘乙醇提取物（FSEE）、60%连翘酯苷A（60% FTA）、90%连翘酯苷A（90% FTA）最佳给药浓度；采用倒置显微镜观察连翘提取物对细胞作用后的细胞形态；采用Griess Reagent法检测细胞培养上清NO含量；流式细胞术检测细胞内活性氧（ROS）的水平。毒性试验结果表明，连翘提取物浓度小于128 μg/mL时，对BEAS-2B细胞没有产生毒性；浓度在128-256 μg/mL时，60% FTA与90% FTA均表现出对细胞的毒性。抗炎结果表明，在给药浓度设置为25、50、100 μg/mL时，三种提取物均表现出减少NO分泌的效果（P〈0.01），90% FTA组存在剂量依赖关系；三种提取物可显著降低LPS诱导的BEAS-2B细胞胞内活性氧的水平（P〈0.05），且呈量效关系。另外，FSEE、60% FTA、90% FTA组间的治疗效果也逐渐增强。由此得出，90% FTA为连翘提取物抗炎作用的主要活性部位，其抗炎活性成分可能为连翘酯苷A，这将为连翘抗炎活性的进一步研究提供基础。

呼吸道病毒与气道上皮细胞的免疫调控

气道是人体与外界交流的重要通道,每天人体经气道吸入空气可达10 000~20 000升,因此不可避免地需要与环境中大量的致病微生物长期接触。与"职业型(professional)"免疫细胞类似,气道上皮细胞(AECs)具有天然免疫功能,能侦测病原体(如不同种属的呼吸道病毒)的入侵并迅速产生宿主免疫反应。近年来的研究发现,为避免慢性炎症和维持免疫稳态,作为"非职业型(non-professional)"免疫细胞的AECs具有重要的调控气道局部免疫力的功能,这些功能包括:(1)AECs可高水平表达模式识别受体(PRRs),又称病原相关模式(PAMP),如Toll样受体家族(TLRs)、维A酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)样受体等,这些受体的存在使得AECs具有灵敏的病原侦测功能。(2)AECs通过调节天然免疫反应的灵敏度,发挥天然免疫和获得性免疫的调节器作用,在气道微环境中通过与"职业型"免疫细胞的互相作用,使针对病原体的宿主免疫反应达到可控的程度。(3)AECs免疫调节功能的缺失或破坏可能引起慢性气道炎症性疾病的发生和发展。本综述聚焦AECs如何通过直接作用和间接作用调控气道免疫能力,应对呼吸道病毒这一类重要的气道病原体感染,并着重阐明由于AECs调控机制的缺失和改变导致气道黏膜免疫功能失调和炎症(如急性和慢性鼻-鼻窦炎)的机制。

纳米氧化锌对人呼吸道上皮细胞白细胞介素-8表达的影响

目的:探讨纳米氧化锌对人支气管上皮细胞(BEAS-2B)及肺泡上皮细胞(A549)内炎症相关因子白细胞介素-8(IL-8)表达的影响。方法:以BEAS-2B及A549细胞作为靶细胞,应用荧光定量PCR技术及ELISA法检测分析不同剂量纳米氧化锌(0、1、2和4μg/cm2)对细胞内IL-8mRNA和蛋白表达的影响。结果:纳米氧化锌作用2、4h,BEAS-2B细胞中IL-8mRNA及蛋白的表达随纳米氧化锌作用剂量的升高而升高(mRNA:F分别为31.985、54.648,P均<0.001;蛋白:F分别为128.686、65.486,P均<0.001);A549细胞中IL-8mRNA及蛋白的表达亦随纳米氧化锌作用剂量的升高而升高(mRNA:F分别为37.652、9.173,P均<0.01;蛋白:F分别为127.299、76.354,P均<0.001)。结论:纳米氧化锌可提高人支气管和肺泡上皮细胞内IL-8mRNA及蛋白的表达水平。

雷公藤多甙下调IL-1β诱导的呼吸道上皮细胞TGF-β_1的表达

目的研究雷公藤提取物(雷公藤多甙)对前炎症因子白介素-1β(IL-1β)诱导的气道上皮细胞转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的调控,以探讨雷公藤在气道重塑中作用的分子机制。方法原代分离新西兰白兔气道上皮细胞,体外培养,随机分5组:正常对照组,IL-1β处理组(加入终浓度为10ng/ml的IL-1β),IL-1β+雷公藤共处理A、B、C组(分别加入终浓度为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml的雷公藤溶液预处理半小时后再给予终浓度为10ng/ml的IL-1β),作用24h收集细胞爬片,采用免疫细胞化学染色方法,观察各组TGF-β1的表达。结果IL-1β处理组(0.511±0.012)TGF-β1表达较对照组(0.138±0·009)显著增强,差异有显著性(均P<0.01),IL-1β+雷公藤共处理A、B、C组(0.353±0.046,0.245±0.034,0.218±0·024)TGF-β1表达较IL-1β处理组减少,差异均有显著性(均P<0.01)。在5-20μg/ml浓度范围内,随雷公藤浓度的增加,气道上皮TGF-β1表达呈浓度依赖性减少。结论雷公藤多甙抑制由IL-1β诱导的气道上皮TGF-β1的过度表达,从而可减轻气道重塑的发生,为雷公藤防治哮喘气道重塑作用的分子机制之一。

表皮生长因子受体及PI3K在硫酸锌诱导人呼吸道上皮细胞间粘附分子-1表达过程中的作用

目的探讨硫酸锌对上皮细胞内细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的影响及其分子生物学机制。方法应用PCR与蛋白质免疫印迹试验检测硫酸锌诱导人呼吸道上皮细胞ICAM-1mRNA与蛋白的表达,以及表皮生长因子受体(EGFR)及PI3K的活化。结果硫酸锌可诱导ICAM-1mRNA与蛋白的过量表达。在同一试验条件下,硫酸锌可诱发EGFR及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)下游激酶Akt的磷酸化或活化。用EGFR抑制剂(PD153035)及PI3K抑制剂(LY294002)预处理上皮细胞,可明显抑制硫酸锌对ICAM-1表达的诱导作用。结论硫酸锌可激活EGFR与PI3K/Akt信号传导通路,进而上调ICAM-1的表达。

呼吸道合胞病毒感染的大鼠气道上皮细胞对树突状细胞的影响

目的探索呼吸道合胞病毒(RSV)感染的气道上皮细胞对大鼠髓系树突状细胞(mDCs)激活和功能的影响,为研究RSV诱发哮喘的机制提供依据。方法大鼠气道上皮细胞株进行培养。在对RSV进行扩增和滴度测定后,以不同作用时间、不同滴度的RSV感染大鼠气道上皮细胞。同时分离、培养扩增大鼠mDCs,采用transwell细胞共培养系统将大鼠气道上皮细胞和大鼠mDCs共培养。其mDCs通过RT-PCR和流式细胞术检测成熟标志物和Th2细胞因子的表达、同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)。结果大鼠mDCs与RSV感染的大鼠气道上皮细胞共培养后出现功能性成熟,包括大鼠mDCs表面共刺激分子MHCⅡ和CD86的表达增多,OX40L和TARC的mRNAs表达增高,大鼠mDCs刺激T细胞增殖的能力增强。结论 RSV感染大鼠气道上皮细胞能够促使大鼠mDCs进一步成熟并且可能具有支持Th2细胞分化和局部聚集的能力,可能是RSV诱发哮喘的一种机制。