H3K27乙酰化修饰促进lncRNA OIP5-AS1转录并通过上调TLR4诱导过敏性鼻炎鼻黏膜上皮细胞凋亡

目的本研究旨在探讨组蛋白3的27位赖氨酸(H3K27)乙酰化修饰对长链非编码RNA OPA相互作用蛋白5-反义RNA1(lncRNA OIP5-AS1)转录的促进作用,探讨其通过调控Toll样受体4(TLR4)对过敏性鼻炎(AR)中鼻黏膜上皮细胞(NEC)凋亡的影响。方法白细胞介素13(IL-13)处理NEC以建立AR细胞模型。采用实时定量PCR检测OIP5-AS1和TLR4在AR患者鼻黏膜组织和体外细胞模型中的表达。ELISA检测粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、嗜酸性粒细胞趋化因子1(eotaxin-1)和黏蛋白5AC(MUC5AC)的浓度。原位末端转移酶标记技术(TUNEL)染色法用于检测NEC的凋亡。双荧光素酶报告实验用于验证OIP5-AS1和TLR4的关系。染色质免疫沉淀(ChIP)实验分析用于验证OIP5-AS1启动子区组蛋白的H3K27乙酰化修饰。结果与健康对照和未处理的NEC相比,OIP5-AS1和TLR4在AR患者鼻黏膜组织和IL-13刺激的NEC中均表达升高。敲减OIP5-AS1可降低IL-13诱导的NEC的TLR4水平,而过表达OIP5-AS1可增加IL-13处理的NEC的TLR4水平。敲减OIP5-AS1可降低IL-13处理的NEC凋亡率及GM-CSF、eotaxin-1和MUC5AC的分泌,而过表达TLR4可部分逆转敲减OIP5-AS1对NEC凋亡及GM-CSF、eotaxin-1和MUC5AC表达的影响。此外,H3K27ac在OIP5-AS1的启动子区域显著富集,H3K27乙酰化可促进OIP5-AS1在IL-13诱导的NEC中的表达。结论H3K27乙酰化修饰促进OIP5-AS1转录并通过上调TLR4诱导AR中NEC凋亡。

骨髓来源的间充质干细胞对变应性鼻炎大鼠鼻黏膜上皮细胞的调控作用

目的研究骨髓间充质干细胞(MSCs)对变应性鼻炎(AR)大鼠鼻黏膜上皮细胞形态、增殖和分泌蛋白的影响。方法分离正常大鼠骨髓MSCs、正常大鼠鼻黏膜上皮细胞以及AR大鼠鼻黏膜上皮细胞并分别培养,细胞培养传代至符合要求时,将骨髓MSCs和AR大鼠鼻黏膜上皮细胞共培养,培养3 d、7 d、14 d时显微镜观察鼻黏膜上皮细胞形态,CCK-8法检测鼻黏膜上皮细胞增殖情况[设模型组(AR大鼠鼻黏膜上皮细胞)和模型MSCs组(AR大鼠鼻黏膜上皮细胞和骨髓MSCs共培养),以OD值表示],Western blot法检测鼻黏膜上皮细胞黏液分泌标志物黏蛋白5AC(MUC5AC)蛋白表达情况[设正常组(正常大鼠鼻黏膜上皮细胞)、正常MSCs组(正常大鼠鼻黏膜上皮细胞和骨髓MSCs共培养)、模型组(AR大鼠鼻黏膜上皮细胞)、模型MSCs组(AR大鼠鼻黏膜上皮细胞和骨髓MSCs共培养)]。结果骨髓MSCs与AR大鼠的鼻黏膜上皮细胞共培养14 d时,鼻黏膜上皮细胞明显增多,细胞生长旺盛,活性好,细胞形成大的集落群。培养14 d时,模型MSCs组的鼻黏膜上皮细胞增殖OD值为0.97±0.06,模型组为0.81±0.05,2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。正常组和正常MSCs组鼻黏膜上皮细胞中MUC5AC蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05);模型MSCs组鼻黏膜上皮细胞中MUC5AC蛋白相对表达量明显低于模型组(P<0.05)。结论骨髓MSCs能促进AR大鼠鼻黏膜上皮细胞增殖,下调AR大鼠鼻黏膜上皮细胞中MUC5AC蛋白表达。

HMGB1小干扰RNA对鼻黏膜上皮细胞HMGB1/TLR4信号通路的影响

目的研究采用小干扰RNA(si-RNA)沉默高迁移率族蛋白1(HMGB1)对人鼻黏膜上皮细胞(HNECs)Toll样受体4(TLR4)及其下游信号通路的影响。方法体外培养人鼻黏膜上皮细胞,分为空白对照组、si-HMGB1组、脂多糖(LPS)组和LPS+si-HMGB1组。RT-PCR检测HNECs中HMGB1 mRNA的表达。Western blot检测4组细胞HMGB1、TLR4表达以及通路下游核因子-κB(NF-κB)和白介素1β(IL-1β)的表达水平。观察siRNA干扰HMGB1蛋白表达后鼻黏膜上皮细胞的相应变化。结果RT-PCR结果显示,LPS组细胞中HMGB1的转录水平显著高于空白对照组(P<0.05)。LPS+si-HMGB1组HMGB1的mRNA转录水平显著低于LPS组(P<0.05)。Western blot检测结果显示,LPS+si-HMGB1组的TLR4,HMGB1蛋白表达水平明显低于LPS组,结果具有统计学意义(P<0.05)。LPS+si-HMGB1组细胞的NF-κB以及IL-1β水平明显低于LPS组(P<0.05)。结论鼻黏膜上皮细胞表达HMGB1蛋白,通过siRNA沉默手段可以下调HMGB1的表达。LPS可以激活炎症性的HMGB1,TLR4,通路下游信号NF-κB及IL-1β。siRNA可以下调HMGB1蛋白表达水平,进而抑制TLR4-NF-κB以及IL-1β信号传导通路。

微小RNA-142-3p靶向肿瘤坏死因子-α对脂多糖诱导的人鼻黏膜上皮细胞炎症反应的影响

目的探讨微小RNA(miR)-142-3p对脂多糖(LPS)诱导的人鼻黏膜上皮细胞(HNEPC)炎症反应的影响及其与TNF-α的靶向关系。方法选取HNEPC为研究对象,使用LPS诱导建立炎症反应模型。将miR-142-3p上调、miR-142-3p下调、空质粒转染至细胞,分为对照组、LPS组、miR-142-3p上调组、miR-142-3p下调组、空质粒组;将TNF-α下调、下调对照质粒分别与miR-142-3p上调质粒共同转染至细胞,记为miR-142-3p上调+TNF-α下调组、空质粒+TNF-α下调组、miR-142-3p上调组和空质粒组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖能力;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-142-3p和白细胞介素(IL)-6、IL-10、干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA水平;采用酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α含量;通过TargetScan网站、荧光素酶报告实验分析miR-142-3p与TNF-α的靶向关系。结果LPS组细胞增殖能力高于对照组,miR-142-3p上调组细胞增殖能力高于空质粒组,miR-142-3p下调组细胞增殖能力低于空质粒组,差异有统计学意义(P<0.05)。LPS组细胞IL-6、IL-10、IFN-γ及TNF-α蛋白及其mRNA表达水平高于对照组,miR-142-3p上调组细胞相关炎性因子表达水平高于空质粒组,miR-142-3p下调组细胞相关炎性因子表达水平低于空质粒组,差异有统计学意义(P<0.05)。TNF-α下调组细胞IL-6、IL-10、IFN-γ及TNF-αmRNA及细胞上清液中蛋白表达水平低于下调对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-142-3p与TNF-α具有良好的靶向关系。结论miR-142-3p在慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者鼻黏膜组织中高表达,过表达miR-142-3p可促进LPS诱导HNEPC炎性反应,可能与上调TNF-α基因表达有关。

麻黄细辛附子汤对尘螨变应原Der p1诱导的鼻黏膜上皮细胞屏障损伤的影响

目的基于RhoA/ROCK信号通路探讨麻黄细辛附子汤及麻黄对尘螨变应原Der p1诱导的人鼻黏膜上皮细胞(HNEpC)屏障损伤的影响及作用机制。方法体外培养HNEpC,将细胞分为对照组、模型组、麻黄组、抑制剂组及麻黄细辛附子汤低、中、高剂量组。电阻仪检测细胞跨膜电阻,酶标仪检测FITCDextran通透性,倒置显微镜观察细胞形态,Western blot检测紧密连接蛋白咬合蛋白(Occludin)、闭合蛋白1(Claudin-1)及通路蛋白RhoA、ROCK1表达,免疫荧光染色检测肌动蛋白(F-actin)表达。结果与对照组比较,模型组细胞间隙增大,出现环形损伤,标准化跨膜电阻显著降低(P<0.01),FITC-Dextran通透性显著增加(P<0.01),Occludin、Claudin-1蛋白表达显著降低(P<0.01),RhoA、ROCK1、F-actin蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,麻黄组、抑制剂组和麻黄细辛附子汤低、中、高剂量组细胞排列紧密,环形损伤被修复,标准化跨膜电阻显著升高(P<0.01),FITC-Dextran通透性显著降低(P<0.01),Occludin、Claudin-1蛋白表达显著升高(P<0.01),RhoA、ROCK1蛋白表达显著降低(P<0.01),麻黄细辛附子汤低、中、高剂量组和抑制剂组细胞F-actin蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论麻黄细辛附子汤及麻黄可能通过抑制RhoA/ROCK信号通路改善鼻黏膜通透性,修复Der p1诱导的HNEpC屏障损伤。

人正常鼻黏膜及鼻息肉黏膜上皮细胞的原代培养及鉴定

目的探讨人正常鼻黏膜及鼻息肉黏膜上皮细胞的原代培养及鉴定,以备后续对其生物学特性研究之用。方法取2006年-2007年行鼻窦内窥镜下摘除的鼻息肉及行鼻中隔手术切除的正常下鼻甲各5例。标本放入4℃无菌的PBS（配有双抗）溶液中,在超净台中反复冲洗、浸泡,剪成米粒大后转入培养瓶中,用0.1%胶原酶Ⅳ消化过夜。次日取出,轻轻吹打,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培养液,置37℃饱和湿度CO2细胞培养箱中培养。采用ABC贴壁法去除鼻黏膜上皮细胞中的成纤维细胞和红细胞。倒置相差显微镜下观察细胞形态、增殖及生长状况、有无污染。流式细胞仪检测细胞纯度。结果鼻黏膜上皮细胞生长良好,可见4种细胞：纤毛柱状上皮细胞、无纤毛柱状上皮细胞、杯状细胞、基底细胞。透射电镜下鼻息肉黏膜上皮细胞膜表面纤毛较正常鼻黏膜上皮细胞的纤毛数减少,纤毛倒伏,胞质内有空泡形成。经流式细胞仪检测鉴定上皮细胞占90.1%。结论此方法培养的鼻黏膜上皮细胞纯度高,是一种较好的获得原代鼻黏膜上皮细胞的方法。

人鼻黏膜上皮细胞的原代培养及传代

目的探讨人鼻黏膜上皮细胞的原代培养及传代方法。方法取鼻内镜下行鼻中隔手术时切除的正常下鼻甲黏膜。以DMEM/F12培养基及Keratinocyte-SFM(K-SFM)培基先后培养及传代,同时培养鼻咽上皮细胞NP69作参照。于倒置显微镜下进行细胞形态学观察,以台盼蓝染色观察细胞活力,免疫细胞化学进行上皮细胞鉴定。结果鼻黏膜上皮细胞呈鹅卵石样生长,传代后形态一致性提高,细胞活力达88.1%,纯度达92.97%,免疫组织化学证实为上皮细胞。结论此方法培养的鼻黏膜上皮细胞活力及纯度高,并可进行一定程度的传代,是获得人鼻黏膜上皮细胞的一种有效方法。

黄芪多糖调控p38 MAPK/NF-κB通路减轻脂多糖诱导鼻黏膜上皮细胞炎症损伤的实验研究

目的探讨黄芪多糖(astragalus polysaccharide,Asp)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的鼻黏膜上皮细胞(nasal mucosal epithelial cell,NMEC)炎症损伤的影响及作用机制。方法取人NMEC细胞株分为对照组、LPS组、Asp组、Anisomycin组和Asp+Anisomycin组。CCK-8法检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡率;免疫荧光法检测p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)阳性表达;免疫组织化学法检测磷酸化核因子κB(phosphorylated nuclear factor kappa B,p-NF-κB)阳性表达;酶联免疫吸附测定检测白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、细胞间黏附因子(intercelluar adhesion molecule,ICAM)-1水平;蛋白质印迹法检测黏蛋白2(mucin 2,MUC2)、p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)、核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)、p-NF-κB蛋白表达。结果LPS处理的NMEC细胞增殖降低、炎症因子分泌增加、凋亡率升高、p38 MAPK/NF-κB通路磷酸化途径激活(P<0.05)。Asp可阻断p38 MAPK/NF-κB途径,缓解NMEC炎症损伤及凋亡(P<0.05)。Anisomycin可逆转Asp的上述作用(P<0.05)。结论Asp可通过抑制p38 MAPK/NF-κB途径,抑制炎症反应,缓解LPS诱导的NMEC炎症损伤及凋亡。

白藜芦醇抗黑碳颗粒对人鼻黏膜上皮细胞毒性作用及其机制

目的 探讨黑碳颗粒(BC)对人鼻黏膜上皮细胞(hNECs)的毒性作用、毒性机制以及白藜芦醇的保护作用。方法 先用不同浓度的黑碳(0、6.5、12.5、25.0、50.0、100.0μg/mL)刺激hNECs,观察BC对hNECs的毒性作用;其次,将h NECs随机分成对照组、BC组、白藜芦醇组,BC组用半致死剂量的BC浓度刺激细胞,白藜芦醇组的浓度为50μmol/L,分别检测3组细胞的存活率,细胞内ROS、SOD和CAT活性,以及8-OHdG蛋白的表达,用彗星试验检测3组细胞DNA损伤的程度。结果 BC对hNECs有细胞毒性作用,并呈剂量依赖性,BC浓度为50μg/mL时细胞存活率为(56.67±4.31)%,以此作为后续实验BC组的刺激浓度。与对照组相比,BC组细胞ROS活性升高、SOD和CAT活性下降,8-OHdG蛋白的表达上调,彗星实验中的各项指标尾长、彗星长、尾距显示DNA损伤,差异均有统计学意义(P<0.05);与BC组相比,白藜芦醇组ROS活性下降,SOD和CAT活性升高,8-OHdG蛋白的表达下调,彗星实验的指标尾长、彗星长、尾距显示DNA损伤程度有所减轻,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 BC对hNECs有毒性作用,可能与氧化应激有关;白藜芦醇可能通过减轻氧化应激反应对鼻黏膜上皮细胞产生保护作用。

免疫磁珠纯化人鼻黏膜上皮细胞的实验研究

目的建立高纯度人鼻黏膜上皮细胞(HNEC)的体外培养方法,为鼻腔制剂的评价提供良好的细胞模型。方法采用酶消化法分离细胞、进行无血清培养。磁珠分选法选择HNEC群,流式细胞仪鉴定纯化前后上皮细胞纯度,扫描电镜下进行形态学观察。结果分离培养的细胞光镜下呈铺路鹅卵石状,电镜下可见丰富的微绒毛和纤毛分化,经流式细胞仪检测鉴定分选后所得细胞纯度达到99%以上。结论磁性分选系统可以直接分离得到高纯度的HNEC,该模型可为鼻腔制剂的药物基础性研究提供实验基础。

白细胞介素-17A对鼻黏膜上皮细胞表达黏蛋白MUC5AC的刺激作用及分子机制

目的观察重组人白细胞介素17A(interleukin-1 7 A,I L-1 7 A)刺激离体培养的人鼻黏膜上皮细胞(human nasal epithelial cells,HNECs)后黏蛋白MUC5AC mRNA的表达变化,并检测相关的信号通路。方法离体培养的HNECs经过IL-17A诱导0～6 h后,通过定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chainreaction,Q-PCR)技术检测MUC5AC mRNA的表达变化;通过Western blot技术检测有无特异性阻断剂作用时p38信号通路的活化情况及相应MUC5AC mRNA的表达情况。结果 IL-17A在1 ng/ml即能诱导HNECs中MUC5AC的mRNA水平上调,并在浓度为100 ng/ml时达到峰值(F=48.60,P<0.01);p38信号通路在IL-17A诱导后开始活化,并在第30分钟达到最大程度,之后信号递减并趋于正常;采用p38特异性阻断剂SB203580抑制p38信号通路后,MUC5AC mRNA的上调得到抑制(F=223.8,P<0.01)。结论 IL-17A能通过p38信号通路诱导HNECs表达MUC5AC mRNA的过程,阻断p38信号通路可能作为干预由IL-17A诱导导致的气道黏液高分泌状态的一个关键靶点。

Toll样受体mRNA在慢性鼻窦炎患者鼻黏膜上皮细胞中的表达

目的 探讨Toll样受体 2 (Toll likereceptor 2 ,TLR 2 )及其Toll样受体 4(Toll likereceptor 4,TLR 4)mRNA在慢性鼻窦炎患者和健康成人鼻黏膜上皮细胞中的表达 ,分析TLR 2和TLR 4在鼻黏膜天然免疫中的作用。方法 应用核酸分子原位杂交技术检测 3 0例慢性鼻窦炎患者和 2 1例健康成人鼻黏膜上皮细胞中TLR 2和TLR 4mRNA的表达。结果 TLR 2和TLR 4mRNA在 3 0例慢性鼻窦炎上皮细胞中均有表达 ,且分别与对照组间差异有显著性意义 (t =8 60 5,P <0 0 0 0 5,t =9 0 50 ,P <0 0 0 0 5)。结论 鼻黏膜上皮细胞中可以产生TLR 2和TLR 4,表明鼻黏膜上皮不仅是单纯的物理屏障 ,更可以通过Toll样受体对病原微生物进行识别 ,以直接启动有效的抗感染机制。

猪小肠黏膜上皮细胞原代培养

分别采用酶消化法和组织块培养法,建立了猪小肠黏膜上皮细胞原代培养的方法。酶消化法于37℃分为4个处理组进行。处理1以2.5 g/L的胰蛋白酶消化30 min;处理2以2.0 g/L胶原酶Ⅰ消化70 min;处理3以50 mg/L嗜热菌蛋白酶消化50 min;处理4以50 mg/L嗜热菌蛋白酶+2.0 g/L胶原酶Ⅰ消化70 min。采用柠檬酸胰酶法分离纯化细胞。结果表明,组织块法原代培养获得的细胞活性较强。

HIF-1α基因干扰对低氧环境下人鼻黏膜上皮细胞TGF-β_1、VEGF、bFGF表达的影响及其机制

目的观察低氧诱导因子1α(HIF-1α)基因干扰对低氧环境下人鼻黏膜上皮细胞(HNEC)转化生长因子β_1(TGF-β_1)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响,并探讨其可能的作用机制。方法体外培养HNEC,取传3代对数生长期细胞随机分为空白对照组、NC-shRNA组、HIF-shRNA组和低氧诱导组。空白对照组不予任何处理,NC-shRNA组、HIF-shRNA组分别予NC-shRNA、HIF-shRNA转染,并于转染24 h后经CoCl_2化学诱导模拟低氧环境;低氧诱导组仅经CoCl_2化学诱导模拟低氧环境。采用实时荧光定量PCR法和Western blotting法检测各组HIF-1α、TGF-β_1、VEGF、b FGF mRNA和蛋白表达;采用Western blotting法检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt表达。结果与空白对照组比较,低氧诱导组HIF-1α、VEGF、TGF-β_1、bFGF mRNA和蛋白表达均明显升高(P均<0.05);与NC-shRNA组比较,HIF-shRNA组上述指标mRNA和蛋白表达均明显降低(P均<0.05)。与空白对照组比较,低氧诱导组p-PI3K、p-Akt蛋白表达明显升高(P均<0.05);与NC-shRNA组比较,HIF-shRNA组p-PI3K、p-Akt蛋白表达明显降低(P均<0.05);各组PI3K、Akt蛋白表达比较P均>0.05。结论低氧诱导HIF-1α表达可促进人鼻黏膜上皮细胞TGF-β_1、VEGF、bFGF表达,干扰HIF-1α基因则抑制上述因子的表达;HIF-1α对上述因子的调控机制可能与其抑制PI3K/Akt信号通路有关。

益气解毒方对TgN(p53mt-LMP1)/HT小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮细胞增殖及细胞周期的影响

目的探讨益气解毒方对TgN(p53mt-LMP1)/HT小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮细胞增殖及细胞周期的影响。方法第4代8月龄TgN(p53mt-LMP1)/HT阳性小鼠和阴性小鼠分别随机分为益气解毒方组和生理盐水组,即转基因阳性生理盐水组(TC)、转基因阳性益气解毒方组(TM)、转基因阴性生理盐水组(NC)和转基因阴性益气解毒方组(NM),共4组,取鼻腔和鼻咽黏膜组织,H-E染色法观察病理组织学变化,流式细胞术测定细胞周期分布特点。结果TC组小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮细胞非典型性增生明显,TC、TM、NM和NC组小鼠鼻腔和或鼻咽黏膜上皮癌前病变率分别为90.9%、10%、0和0,组间比较差异具有统计学意义(P<0.01)。与NC组小鼠比较,TC组小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮G0/G1期细胞量减少,S期、G2/M期细胞数量增多,细胞增殖指数(PI)增高,差异有统计学意义(P<0.01);与TC组比较,TM组小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮组织G0/G1期细胞量增多,S期、G2/M期细胞数量减少,细胞PI降低,差异有统计学意义(P<0.01),趋于正常水平,而与NC组的差异均无统计学意义。结论益气解毒方中药可有效逆转或阻止TgN(p53mt-LMP1)/HT转基因小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮细胞的非典型性增生,其作用机制之一是阻止细胞进入S期而抑制细胞增殖。

苯环喹溴铵对脂多糖诱导的人鼻黏膜上皮细胞表达MUC5AC的影响

目的探讨苯环喹溴铵(bencycloquidium bromide,BCQB)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人鼻黏膜上皮细胞(human nasal epithelial cells,HNECs)表达黏蛋白MUC5AC的影响。方法将体外培养的原代人鼻黏膜上皮细胞分成对照组(C,不予任何处理)、LPS组(LPS,加入LPS1 mg·L^(-1))、BCQB低剂量组(BCQBL,加入LPS 1 mg·L^(-1)及BCQB 10-8mol·L^(-1))、BCQB中剂量组(BCQBM,加入LPS 1 mg·L^(-1)及BCQB 10^(-7)mol·L^(-1))、BCQB高剂量组(BCQBH,加入LPS 1 mg·L^(-1)及BCQB 10^(-6)mol·L^(-1))和异丙托溴铵组(ipratropium bromide,IB,加入LPS 1 mg·L^(-1)及IB 10^(-6)mol·L^(-1))。经含生长因子的无血清培养基37℃,5%CO_2培养24 h后,采用Real-time PCR法检测鼻黏膜上皮细胞中MUC5AC mRNA的表达,Western blot法检测鼻黏膜上皮细胞中MUC5AC蛋白表达,ELISA法检测上清液中MUC5AC蛋白表达。结果 LPS组与对照组相比,MUC5AC mRNA和蛋白表达明显升高(均P<0.01),BCQB各剂量组与LPS组相比,MUC5AC mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.01,P<0.05),且高剂量组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 BCQB能够抑制LPS诱导的人鼻黏膜上皮细胞黏蛋白MUC5AC表达,提示其可能成为鼻腔黏液高分泌性疾病治疗新药。

诱发型一氧化氮合酶在人类鼻黏膜上皮细胞中的表达

目的 探讨人类鼻黏膜上皮细胞应答炎性刺激因子白细胞介素 1 β(interleukin 1 β ,IL 1 β)和肿瘤坏死因子 (tumornecrosisfactor α ,TNF α) ,合成诱发型一氧化氮合酶 (induciblenitricoxidesynthase ,iNOS)的能力及其机制 ,以及类固醇药物对上皮细胞的影响。方法 将人类鼻黏膜上皮细胞(包括鼻息肉上皮细胞 ,下鼻甲上皮细胞 )进行无血清原代细胞培养 ,分别加入各种不同浓度的炎性刺激因子 (IL 1 β和TNF α)以及地塞米松 ,采用原位杂交的方法检测不同条件下iNOSmRNA的水平。结果 ①不论用IL 1 β或是TNF α刺激 ,iNOSmRNA水平均随浓度的增加 ,时间的延长而增加 ,尤以鼻息肉上皮细胞明显。但当浓度到一定水平后 ,iNOSmRNA水平不再继续升高 ;②用IL 1 β +TNF α共同刺激 ,iNOSmRNA水平要高于单纯用其中的一种 (P <0 .0 1 ) ,同样鼻息肉上皮细胞iNOSmRNA水平要高于下鼻甲上皮细胞 ;③加入地塞米松后 ,被炎性因子诱发的iNOSmRNA升高的水平下降。当地塞米松浓度为 4 0ng/ml以上时 ,iNOSmRNA水平不再继续下降。 结论 ①IL 1 β和TNF α上调人类鼻黏膜上皮细胞合成的iNOSmRNA水平 ,鼻息肉上皮细胞更为活跃。它的机制可能是通过核因子 κB途径 ;②地塞米松降低这种上调作用 ,它的机制可能是通过阻断核?

IL-1β/p38MAPK/NF-κB信号转导通路体外调节鼻黏膜上皮细胞中糖皮质激素受体的表达

目的:拟通过体外研究初步探讨慢性鼻-鼻窦炎黏膜中GRα/GRβ降低的可能上游信号转导机制。方法:以IL-1β体外诱导人鼻黏膜上皮细胞(HNE)构建GRα/GRβ降低的模型。以Western印记及荧光定量PCR技术检测IL-1β诱导前后及p38MAPK和NF-κB信号通路特异性阻断剂干预前后GRα、GRβ和p38MAPK、NF-κB信号通路关键酶在蛋白质及核酸水平的表达变化。结果:IL-1β呈浓度和时间依赖性诱导HNE中GRα/GRβ降低,成功建立GRα/GRβ降低的细胞模型。相同梯度的IL-1β可呈相同规律诱导HNE中p38MAPK和NF-κB通路激活。p38MAPK和NF-κB通路的特异性阻断剂SB203580和吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)均可明显抑制各自通路,且同时出现GRα/GRβ增高。SB203580可明显降低NF-κBp50和NF-κBp65的表达,PDTC对p38MAPK的表达未见明显影响。结论:IL-1β通过先后激活p38MAPK和NF-κB信号通路诱导体外培养的HNE中GRα/GRβ降低。

细颗粒物(PM2.5)降低人鼻黏膜上皮细胞闭合蛋白(occludin)的表达

目的探讨细颗粒物(PM2.5)对人正常鼻黏膜上皮细胞间闭合蛋白(occludin)表达及分布的影响。方法采用(0、 50、 100、 200、 400、 500、 800、 1000)μg/mL PM2.5处理体外培养的正常人HNEpC鼻黏膜上皮细胞,采用CCK-8法检测细胞活力,确定最佳处理剂量;后续采用(200、 400、 500)μg/mL PM2.5处理HNEpC细胞,用免疫荧光细胞化学染色法检测细胞occludin的表达和分布情况,实时荧光定量PCR检测occludin的mRNA水平, Western blot法检测occludin蛋白水平。结果与阴性对照组(0μg/mL PM2.5)相比,各剂量PM2.5处理鼻黏膜上皮细胞24 h和48 h后,细胞活性均降低,且细胞活性与PM2.5剂量呈负相关。与阴性对照组相比, 200μg/mL PM2.5组,细胞形态及细胞间occludin蛋白分布表达无明显改变; 400μg/mL PM2.5组,细胞形态变为梭形,细胞间隙增宽; 500μg/mL PM2.5组,细胞数量明显减少,细胞形态变为长梭形,细胞间隙增宽明显;除200μg/mL PM2.5处理细胞24 h外,其余各组细胞occludin mRNA及蛋白水平均下调,且occludin蛋白表达水平呈时间依赖性。结论 PM2.5可降低正常人HNEpC鼻黏膜上皮细胞活性、降低occludin的表达和分布。

鼻咽黏膜上皮内淋巴细胞在鼻咽癌时的变化

目的:研究鼻咽黏膜上皮内淋巴细胞(mucosa intraepithelial lymphocyte,mIEL)在鼻咽癌时的变化,初步探讨局部上皮增生活跃程度对mIEL的影响。方法:(1)收集可见黏膜上皮的51例鼻咽慢性炎症(NPi)和90例鼻咽癌(NPC)石蜡标本。(2)在HE切片上计数黏膜上皮内淋巴细胞、癌巢内淋巴细胞,判定巢间淋巴细胞浸润程度。(3)对部分病例用CD3、CD4、CD8(Npi20例,NPC33例)和PCNA抗体(Npi48例,NPC80例)进行免疫组化染色。结果:(1)NPC组mIEL数量明显少于NPi组[(4.53±3.87)vs(6.33±7.20),P=0.017],但其在NPC各期和有无淋巴结转移之间变化不明显(P>0.05)。(2)NPC组mIEL与其巢内、癌巢间淋巴细胞数量(P=0.011,P=0.018)和组织中T细胞数量变化(P=0.037)均呈正相关。(3)NPC组黏膜上皮PCNA表达强度与mIEL数量变化呈正相关(P=0.007)。结论:(1)NPC组mIEL明显减少,但在其肿瘤进展过程中变化不显著;(2)NPC组mIEL变化与其组织中淋巴细胞浸润情况和T淋巴细胞变化一致;(3)NPC组mIEL数量随黏膜上皮增生活跃程度而增加。