补肾调泡周期疗法组方对大鼠原代卵巢颗粒细胞增殖、分泌及AMH、AMHR2、Smad4表达的影响

目的研究补肾调泡周期疗法组方(逍遥散、三子汤)对大鼠原代卵巢颗粒细胞增殖、分泌功能及抗苗勒氏管激素(AMH)、抗苗勒氏管激素Ⅱ型受体(AMHR2)、Smad同源物4(Smad4)表达的影响。方法6~8周龄SD雌鼠20只随机分为空白组、阳性药物组(7.8 IU·kg^(-1)FSH)、逍遥散组(12 g·kg^(-1))、三子汤组(16 g·kg^(-1))各5只,连续给药4 d后采血,制备含药血清。选取21~25日龄SD雌鼠提取大鼠卵巢颗粒细胞,贴壁生长至70%,用免疫荧光法进行大鼠卵巢颗粒细胞纯度鉴定。培养成功的大鼠原代卵巢颗粒细胞分别用各组含药血清培养液培养,CCK-8法筛选各组含药血清最佳干预浓度;各组采用最佳干预浓度培养细胞,CCK-8法检测各组颗粒细胞24、48、72、96 h增殖情况;ELISA法检测各组颗粒细胞培养液上清AMH、雌二醇(E_(2))及孕酮(P)浓度;Western Bolt法检测各组颗粒细胞AMH、AMHR2和Smad4蛋白表达;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组颗粒细胞中AMH、AMHR2和Smad4 mRNA表达水平。结果与空白组比较,各组含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞增殖均有促进作用(P<0.05,P<0.01);与阳性药物组比较,三子汤组促进颗粒细胞增殖作用最佳(P<0.01),逍遥散次之(P<0.05);各组颗粒细胞增殖与含药血清干预时间呈正相关,干预48 h启动细胞增殖活性,96 h细胞增殖达到高峰。与空白组比较各组颗粒细胞培养液上清AMH、E_(2)及P的浓度均明显升高(P<0.05,P<0.01);与阳性药物组比较,逍遥散组促P分泌效果更佳(P<0.05)。与空白组比较各组卵巢颗粒细胞AMH、AMHR2、Smad4蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),阳性药物组AMHR2蛋白表达较逍遥散、三子汤组升高明显(P<0.01)。与空白组比较各组卵巢颗粒细胞AMH、AMHR2、Smad4 mRNA表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),其中三子汤组AMH、AMHR2 mRNA表达明显优于阳性药物组与逍遥散组(P<0.01)。结论补肾调泡周期疗法组方逍遥散、三子汤能促进大鼠原代卵巢颗粒细胞增殖并与干预时间呈正相关性,促进颗粒细胞分泌甾体激素和AMH,并可能通过上调AMH、AMHR2、Smad4蛋白及mRNA表达,促进卵泡发育和成熟,并以此改善卵巢生殖和内分泌功能。

慢病毒介导的Bcl-2基因对磷酰胺氮芥诱导人原代卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用

目的探讨携带Bcl-2基因的慢病毒对磷酰胺氮芥诱导体外培养的原代人卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用。方法利用分子生物学技术,成功构建携带Bcl-2基因慢病毒载体,包装成高滴度慢病毒,将重组慢病毒体外感染人卵巢原代颗粒细胞,再加入浓度30μmol/L的磷酰胺氮芥诱导细胞凋亡。分为4组进行实验:(a)实验组:pGC-FU-Bcl-2+磷酰胺氮芥(PM);(b)空载对照组:pGC-FU-EGFP+PM;(c)实验对照组:只加PM;(d)空白对照组:不加PM及病毒。采用流式细胞仪、Hoechst 33258染色检测卵巢颗粒细胞凋亡情况;利用Western blot检测Bcl-2蛋白的表达情况。结果空白对照组(GCs),凋亡峰不明显,颗粒细胞凋亡率为(1.93±0.28)%,实验组(GCs+PM+pGC-FU-Bcl-2)出现微弱的凋亡峰,颗粒细胞凋亡率为(6.99±0.55)%,比实验对照组(GCs+PM)及空载对照组(GCs+PM+pGC-FU-EGFP)显著低,但显著高于空白对照组(P<0.05)。实验组Bcl-2蛋白的表达明显增高,显著高于其余各对照组(P<0.05)。结论携带Bcl-2基因的慢病毒感染靶细胞后可以过度分泌Bcl-2蛋白,显著抑制卵巢颗粒细胞的凋亡,保护PM对颗粒细胞的理化损伤。

携带人bcl-2基因的慢病毒表达载体的构建及其在人原代卵巢颗粒细胞中的表达

目的构建及鉴定bcl-2基因慢病毒表达载体,并观察在体外人卵巢原代颗粒细胞中的表达。方法采用PCR技术从含有人bcl-2基因的质粒克隆模板pCMV-SPORT6钓取bcl-2基因,并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含EGFP基因)中,构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-bcl-2,通过酶切、测序验证bcl-2基因后,将pGC-FU-bcl-2质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelp-er2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带bcl-2基因和EGFP基因的重组慢病毒GC-FU-bcl-2,并转染靶细胞人卵巢原代颗粒细胞。通过检测标志蛋白增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和目的蛋白bcl-2进一步验证pGC-FU-bcl-2在靶细胞中的表达。结果(1)pGC-FU-bcl-2中携有正确的bcl-2基因,并能在人类细胞中表达;pGC-FU-bcl-2共转染包装细胞293T能产生重组病毒GC-FU-bcl-2;(2)目的基因bcl-2能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞人卵巢原代颗粒细胞,并达到稳定的表达,荧光显微镜下能直接观察到GFP,Westernblotting能检测到bcl-2蛋白在靶细胞中的表达。结论成功构建了携带bcl-2基因的重组慢病毒载体,转染人卵巢原代颗粒细胞后能够稳定表达bcl-2基因,为进一步研究bcl-2的功能和细胞凋亡相关疾病的治疗奠定基础。

FSH对缺血缺氧诱导的小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用

目的探究促卵泡刺激素(FSH)对缺血缺氧损伤的小鼠原代卵巢颗粒细胞的保护作用。方法21日龄雌性ICR小鼠注射孕马血清(PMSG)42 h后,体外分离并培养小鼠原代卵巢颗粒细胞,分为对照组、单纯缺血缺氧组、缺血缺氧FSH干预组(0.1、0.2、0.4、0.6 IU·mL^(-1) FSH)。对单纯缺血缺氧组及缺血缺氧FSH干预组的细胞分别进行缺血缺氧处理及不同浓度FSH干预,通过TUNEL染色及流式细胞术检测细胞凋亡情况;通过Western blot检测抗凋亡蛋白Bcl-2、凋亡蛋白Bax的表达情况。结果TUNEL检测细胞结果显示:单纯缺血缺氧组TUNEL阳性细胞数最多、细胞凋亡率最高,FSH干预能够减少细胞凋亡,其中0.4、0.6 IU·mL^(-1) FSH干预组TUNEL阳性细胞较其他干预组减少,细胞凋亡率降低(P均<0.01);流式细胞术结果显示:除对照组外,其余各组凋亡率均有所增加(P均<0.01),在添加不同浓度FSH干预后,细胞凋亡被抑制,其中0.4 IU·mL^(-1) FSH干预组细胞凋亡率低于单纯缺血缺氧组和0.1 IU·mL^(-1) FSH干预组(P均<0.05);Western blot检测凋亡相关蛋白结果显示:与对照组相比,其余各组Bax蛋白表达均上调,Bcl-2蛋白表达量、Bcl-2/Bax比值均降低,0.4 IU·mL^(-1) FSH干预组的Bcl-2蛋白表达量、Bcl-2/Bax比值均高于单纯缺血缺氧组和其他干预组(P均<0.01)。结论添加FSH能抑制缺血缺氧诱导的小鼠颗粒细胞凋亡,降低细胞凋亡率,增强细胞的抗凋亡能力。

携带Bcl-2基因的慢病毒对磷酰胺氮芥抑制卵巢颗粒细胞体外分泌功能的影响

目的:探讨携带Bcl-2基因的慢病毒抑制磷酰胺氮芥(PM)对体外培养的人原代卵巢颗粒细胞(GCs)的凋亡情况及其分泌功能的影响。方法:实验分4组:实验组,pGC-FU-Bcl-2+PM;空载对照组,pGC-FU-EGFP+PM;实验对照组,只加PM;正常对照组,不加PM及病毒。采用DNA ladder检测GCs凋亡情况,利用放射免疫法检测细胞培养上清液中雌二醇及孕酮的浓度。结果:实验对照组及空载对照组的DNA ladder表现为明显的梯状带形,正常对照组及实验组DNA ladder无明显的梯状带形。各组之间雌二醇及孕酮的基础浓度经统计学分析表明差异无显著性,实验组与相应时间点实验对照组及空载对照组相比差异均存在显著性(P<0.01),实验对照组与空载对照组相比差异无显著性(P=0.990,P=0.523)。结论:携带Bcl-2基因的慢病毒感染人原代卵巢GCs后,显著降低了PM诱导的细胞凋亡,改善了GCs在体外分泌雌二醇及孕酮的功能。

三氯生对原代大鼠卵巢颗粒细胞孕酮分泌影响的实验研究

目的:研究三氯生对原代大鼠卵巢颗粒细胞孕酮(P4)分泌功能的影响。方法:原代大鼠卵巢颗粒细胞培养备用。取备用的卵巢颗粒细胞采用不同浓度的三氯生(0、0.01、0.1、1μM)染毒。24 h后分别采用MTT法检测颗粒细胞的相对活力、酶联免疫法(ELISA法)检测颗粒细胞P4分泌水平、实时荧光定量PCR法(q RT-PCR)及western blot法检测类固醇激素合成急性调节蛋白(St AR)、胆固醇侧链裂解酶(P450scc)以及3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)的基因及蛋白表达水平。结果:三氯生在本研究所采用的浓度范围内对颗粒细胞的活性并没有影响(P>0.05);三氯生(0.1、1μM)可抑制颗粒细胞P4的分泌,且呈现剂量依赖性下降(P<0.05)。三氯生(0.1、1μM)可使St AR的基因表达水平显著增高、P450scc的基因表达水平下降(P<0.05)。1μM三氯生可使St AR及P450scc的蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。三氯生对3β-HSD的基因及蛋白表达水平皆没有影响(P>0.05)。结论:三氯生可抑制原代大鼠卵巢颗粒细胞的P4分泌,对类固醇激素合成关键分子的影响可能是其作用机制之一。

脱氢表雄酮对大鼠颗粒细胞激素生成的作用

为了探讨脱氢表雄酮(DHEA)对大鼠原代卵巢颗粒细胞激素生成及相关甾体生成酶的影响,采用机械法分离培养大鼠原代卵巢颗粒细胞,放射免疫分析法检测培养液中雌二醇、孕酮和睾酮的含量;Real-time PCR法检测类固醇代谢途径中3β-羟基固醇脱氢酶(3β-HSD)、17β-羟基固醇脱氢酶(17β-HSD)、CYP450 mRNA的表达变化。结果显示:10μmol/L DHEA处理48 h后可显著促进大鼠原代卵巢颗粒细胞雌二醇(P<0.05)、孕酮(P<0.01)和睾酮的分泌量(P<0.01);显著促进3β-HSD(P<0.01)和17β-HSD(P<0.05)mRNA的表达,CYP450 mRNA表达略有降低,但无统计学意义。说明外源性DHEA处理可能通过调节3β-HSD、17β-HSD和CYP450等相关酶的基因表达,进而影响大鼠原代卵巢颗粒细胞雌激素和雄激素的分泌。