Aβ_(25-35)对原代培养大鼠皮质神经元的损伤作用

目的考察Aβ25-35对原代培养大鼠皮质神经元的损伤作用。方法将原代培养的大鼠皮质神经元分为对照组、谷氨酸(glutamate,Glu)组及3个浓度的Aβ25-35组,每组各6孔。观察神经元的形态改变,并测定细胞存活率及培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的活力值。结果与对照组比较,Glu组可造成大鼠皮质神经元明显损伤,形态发生显著改变,细胞存活率为(53.1±5.5)%(P<0.01),并且培养液中LDH漏出显著增多,LDH的活力值为(39.9±2.9)U/gProt(P<0.01);Aβ25-35三个剂量组神经元存活率均显著降低,分别为(69.3±5.9)%(P<0.01)、(52.7±3.0)%(P<0.01)和(33.2±1.8)%(P<0.01),Aβ25-35低、中剂量组培养液中LDH漏出未见明显改变,LDH活力值分别为(23.5±1.4)U/gProt和(24.7±1.3)U/gProt(P>0.05),Aβ25-35高剂量组培养液中LDH漏出显著升高,LDH活力值为(38.8±2.0)U/gProt(P<0.01),与Glu组相当(P>0.05)。结论 Aβ25-35能剂量依赖性地损伤皮质神经元,1μmol/LAβ25-35剂量组处理24h后细胞存活率可降低50%左右,可用于Aβ25-35体外诱导阿尔茨海默病细胞模型的建立。

葡萄糖剥夺对原代培养大鼠皮层神经元BKCa通道的影响

目的:观察常氧葡萄糖剥夺对原代培养大鼠皮层神经元膜上BKCa通道活性的影响。方法:原代培养乳鼠大脑皮层神经元随机分为正常对照组(C)、糖剥夺1 h组(GD1)、糖剥夺2 h组(GD2)、糖剥夺3 h组(GD3)、糖剥夺4 h组(GD4)和糖剥夺5 h组(GD5),采用膜片钳内面向外模式观察无糖能量耗竭模型对神经元BKCa通道的影响。结果:随葡萄糖剥夺后孵育时间的延长(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h),细胞形态发生变化,活性下降;虽然葡萄糖剥夺对BKCa单通道电导无明显影响,但是,无糖孵育1 h就明显影响通道活性,使其平均开放概率(NPo)和通道平均开放时间(To)显著增加,伴平均关闭时间(Tc)的缩短。在葡萄糖剥夺2 h、3 h到4 h的过程中,其NPo渐加大,To渐延长,Tc则渐缩短。在葡萄糖剥夺5 h时,较4 h的NPo降低,To稍减少,Tc稍延长。结论:葡萄糖缺乏1 h就可使BKCa通道过度激活,使神经元超极化,葡萄糖缺乏5 h可能损伤通道功能。

蓖麻油甾醇组成及其对大鼠蜕膜细胞的影响

目的进一步探明蓖麻油中的抗生育物质成分。方法利用皂化和萃取,从蓖麻油中提取甾醇,用GC-MS分析蓖麻油甾醇成分;用MTT法检测蓖麻油甾醇对原代培养大鼠蜕膜细胞活力的影响。结果蓖麻油总甾醇的主要成分为γ-谷甾醇(43.02%)、豆甾醇(27.15%)、岩藻甾醇(11.43%)、麦角甾-5-稀-3-醇(6.00%)和普罗布考(7.46%)。蓖麻油甾醇对细胞活力有抑制作用,其半抑制剂(IC50)剂量为:(88.45±3.196)μg/ml,r=+0.9549;抑制作用具有量-效关系。结论在蓖麻油甾醇的主要成分中,γ-谷甾醇(r-Sitosterol)可能是抑制原代培养大鼠蜕膜细胞活力的主要成分,而豆甾醇(stigmasterol)可能起协助的作用。

体内外急性酒精性肝损伤模型的研究

目的:建立体内外急性酒精性肝损伤模型,为进一步研究药物对肝损伤的保护作用奠定基础。方法:测定乙醇的半数致死量,观察不同给药途径不同剂量下血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性变化。利用乙醇体外诱导原代培养的肝细胞损伤,检测不同时间和剂量下培养液上清乳酸脱氢酶(LDH)释放量。结果:小鼠灌胃乙醇的半数致死量为9．98 g·kg-1,乙醇灌胃剂量大于6．4 g·kg-1、腹腔注射剂量大于4．0 g·kg-1时,血清ALT、AST有升高趋势。50-400 mmol·L-1乙醇作用于大鼠肝细胞,培养液上清中LDH释放量有增加趋势。结论:体内、体外急性酒精性肝损伤的最适损伤剂量分别为7．2 g·kg-1和50～100 mmol·L-1。

苯氧茚酮类乙酰胆碱酯酶抑制剂YKY-7对β淀粉样蛋白诱导的神经细胞损伤的保护作用

目的观察苯氧茚酮类乙酰胆碱酯酶抑制剂YKY-7对β淀粉样蛋白25-35(β-amyloid peptide25-35,Aβ25-35)诱导的神经细胞损伤的保护作用及机制。方法以Aβ25-35诱导原代培养的大鼠皮层神经元和人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞损伤模型,光学显微镜下观察细胞形态学以及MTT法检测YKY-7及多奈哌齐(donepezil)对损伤模型中神经细胞活率的影响,荧光显微镜、透射电镜、流式细胞仪检测YKY-7对Aβ25-35诱导的神经细胞病理性凋亡过程的影响,MTT法检测PI3K-Akt阻断剂LY294002对YKY-7神经细胞损伤保护作用的影响。结果 12.5μmol·L-1YKY-7可提高经Aβ25-35处理的大鼠皮层神经元和SK-N-SH细胞活率,且该保护作用强于相同浓度donepezil;12.5μmol·L-1YKY-7可减弱Aβ25-35诱导的SK-N-SH细胞凋亡损伤;LY294002可阻断YKY-7对Aβ25-35诱导的SK-N-SH细胞损伤的保护作用。结论苯氧茚酮类乙酰胆碱酯酶抑制剂YKY-7对Aβ25-35诱导的神经细胞凋亡具有一定的保护作用,该作用可能是通过PI3K-Akt信号通路调控。

密度梯度离心法同时分离新生大鼠原代心肌细胞与成纤维细胞

本文旨在探讨一种改良的同时分离新生大鼠原代心肌细胞和成纤维细胞的方法,以建立良好的原代心肌细胞及成纤维细胞研究模型。无菌状态下取Wistar乳鼠(出生不超过2天)心室,用II型胶原酶消化,控制消化时间及次数、搅拌速度、离心次数和速度等,结合Percoll密度梯度离心法分离心肌细胞及成纤维细胞,进行体外培养,观察细胞形态,继而用0.2%台盼蓝染色检测细胞存活率,免疫荧光染色法检测心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,c Tn I)、波形蛋白(Vimentin)及α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达,分别用于鉴定心肌细胞和成纤维细胞纯度。结果显示,本方法5次分离的心肌细胞平均存活率达92%,纯度达95%以上,细胞生长状态良好,可见贴壁自发搏动;成纤维细胞平均存活率达96%,纯度达94%。本方法能同时获得新生大鼠原代心肌细胞和成纤维细胞,具有很高的产量、存活率及纯度,且操作简便,耗时短,重复性好,是一种较为理想的原代细胞分离、培养方法,可满足各种后续实验要求。