砷对原代培养海马神经细胞凋亡的研究

目的 观察砷对海马神经细胞凋亡的影响。方法 采用光学显微镜、流式细胞术和免疫细胞化学方法检测砷致海马神经细胞凋亡。结果 随着砷剂量加大 ,作用时间延长 ,海马神经细胞逐渐出现凋亡的形态学改变。流式细胞术检测 ,砷可使亚二倍体峰的高度增高 ,面积增大。免疫细胞化学和图像分析显示海马神经细胞浆内Bax表达上调。结论 砷在一定剂量和作用时间内可致海马神经细胞的凋亡。

HIF-1α基因转染对β-淀粉样蛋白25-35诱导原代培养海马神经细胞凋亡的影响

目的构建人类缺氧诱导因子-1α(human hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)基因真核表达载体pSNAV-HIF-1α,并观察其对β-淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)诱导原代培养海马神经细胞凋亡及细胞内游离钙离子浓度的影响。方法采用基因重组技术,将pBSKhHIF1αT7原核表达载体上HIF-1α基因序列克隆至真核表达载体pSNAV2.0,磷酸钙共沉淀法介导转染pSNAV-HIF-1α,Aβ25-35诱导原代培养海马神经细胞凋亡。Western blot检测HIF-1α蛋白表达,流式细胞术分析细胞凋亡百分率,激光共聚焦显微镜测定细胞内游离钙离子浓度。结果酶切、PCR及DNA测序结果均表明成功构建了重组质粒pSNAV-HIF-1α,磷酸钙共沉淀法介导的pSNAV-HIF-1α质粒转染显著增加了海马神经细胞HIF-1α蛋白表达(P<0.05),同时可显著降低Aβ25-35诱导海马神经细胞凋亡百分率及细胞内游离钙离子浓度上调(P<0.05)。结论缺氧诱导因子-1α基因转染可能通过抑制细胞内游离钙离子浓度上调使海马神经细胞对Aβ25-35产生抗凋亡作用。

孕酮对原代培养海马神经细胞谷氨酸损伤的保护作用

目的观察孕酮对原代培养海马神经细胞谷氨酸损伤的保护作用。方法取新生大鼠海马神经细胞进行体外原代培养,建立谷氨酸对培养海马神经细胞兴奋毒性损伤模型,在相差显微镜下观察孕酮处理前后神经细胞形态变化,乳酸脱氢酶活性测定试剂盒检测细胞培养上清乳酸脱氢酶漏出量。结果孕酮组神经细胞部分形态保持较好,生长情况明显好于谷氨酸组,乳酸脱氢酶漏出量较谷氨酸组减少。结论孕酮对体外培养的海马神经细胞谷氨酸兴奋毒性损伤具有保护作用。

高渗透压晶体-胶体混合液对原代培养海马神经细胞糖代谢的影响

目的：观察在不同浓度HHS混合液中海马神经细胞葡萄糖的代谢状况。方法：将原代培养大白鼠胚胎的海马神经细胞暴露于不同浓度HHS混合液15min后，测其细胞内[^14C]脱氧葡萄糖-6-磷酸的含量。结果：暴露于0．05％、0．1％和0．25％HHS混合液15min后，胞内脱氧葡萄糖-6-磷酸的含量在15min和60min时明显增加(P<0．05)，与同一时间的对照值相比也明显升高(P<0．05)。及至1天和7天后，海马神经细胞内脱氧葡萄糖-6-磷酸的含量恢复至实验前对照值水平(P>0．05)。结论：海马神经细胞在暴露于不同浓度的高晶体-高胶体渗透压混合液15min后，在60min内对葡萄糖的吸收增加，但至少需1-7天方可恢复到正常的葡萄糖代谢状态。

谷氨酸对原代培养海马神经细胞兴奋毒作用的研究

为更清楚地了解药物对神经元的损伤和保护作用，在体外对新生大鼠（０～１ｄ）海马神经细胞进行原代培养，建立了谷氨酸对原代培养海马神经细胞兴奋性神经毒损伤模型。通过检测神经细胞乳酸脱氢酶泄漏率和在相差显微镜下对神经细胞形态变化的观察，发现只有发育成熟的神经元对谷氨酸兴奋毒损伤最敏感，神经元的兴奋毒损伤对谷氨酸在一定范围内有剂量依赖性或接触时间依赖性关系，提示谷氨酸通过与其受体结合造成神经元兴奋毒损伤。

一种低密度及高纯度胎鼠原代海马神经元培养方法的优化及鉴定

目的通过将海马、皮层细胞共培养的方式建立一种低密度、高纯度、高稳定性的大鼠胎鼠原代海马神经元体外培养方法,以获取纯度更高、活力更好的原代海马神经元。方法分离孕16~18 d SD大鼠胎鼠的海马和皮层并分别剪碎,经0.125%胰蛋白酶消化后用200目细胞筛过滤,将获得的细胞悬液以包围的形式分别接种于培养板的内层和外环上,于含10%马血清的DMEM/F12培养基中进行共同培养,4~6 h细胞贴壁后更换培养基为维持培养基培养(Neurobasal培养基+2%B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺)。通过CCK-8试剂盒检测细胞活力,利用免疫荧光染色检测海马神经元纯度。结果海马神经元在5 d后形成纵横交错的神经网络,生长状态较好,经鉴定海马神经元的纯度高达98%,且能够稳定存活3周。结论利用海马、皮层细胞共培养的方法可以获取高纯度、高活性、高存活率、高稳定性的胎鼠原代海马神经元,可为神经系统中海马神经元相关疾病研究提供一定的实验条件。

氯化铝致原代培养大鼠海马神经细胞毒性作用

目的研究铝对体外培养海马神经细胞的毒作用及神经毒性毒作用机制。方法分别用浓度为10,100,1000μmol/L的AlCl3对原代培养大鼠海马神经细胞染毒24和48 h,检测AlCl3对海马神经细胞形态影响;吖啶橙-溴化乙锭染色判断海马神经细胞存活率;Hoechst 33258染色判断海马神经细胞凋亡。结果AlCl3可造成海马神经细胞突起萎缩,细胞胞体增大变圆、细胞数量减少,并且细胞界限不清,并随着AlCl3浓度增加和染毒时间延长而加重,具有明显剂量-反应关系。AlCl3对海马神经元生长有明显的抑制作用,与对照组比较,呈现明显时间-剂量-反应关系(P<0.05)。AlCl3可使海马神经细胞胞核明显固缩、凝集或断裂,发生典型的凋亡改变,随着染毒时间延长和A13+浓度增加,凋亡发生率也明显增加。结论铝可对原代培养海马神经细胞产生细胞毒性,可引起细胞结构改变,抑制海马神经细胞生长,并可诱导细胞凋亡。

小鼠原代海马神经元培养方法优化及HT22-GRK2^(-/-)细胞构建

目的 探究并优化新生小鼠海马神经元体外原代培养方法;构建小鼠海马神经元HT22细胞中G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)基因敲除细胞株(HT22-GRK2^(-/-))。方法 为优化小鼠原代海马神经元的培养,取新生1~2 d C57BL6/J小鼠海马组织,经胰酶消化后吹打形成细胞悬液,于Neurobasal-A培养基中加细胞培养添加剂维持细胞生长。利用CRSIPR/Cas9基因编辑技术构建HT22-GRK2^(-/-)细胞株,并通过免疫荧光染色和Western blot检测GRK2敲除效率。结果 以3×10^(7)/孔密度接种的新生小鼠原代海马神经元以无血清培养方式接种于6孔板中,可获得纯度高、活性好的小鼠原代海马神经元细胞;HT22-GRK2^(-/-)细胞株构建成功。结论 成功建立并优化小鼠海马神经元体外原代培养方法,利用CRSIPR/Cas9基因编辑技术成功构建HT22-GRK2^(-/-)细胞株。

铝对原代培养大鼠海马神经细胞毒性作用的初步观察

新生一天的大鼠海马神经细胞在含10％胎牛血清和10％小牛血清的DMEM培养液,5％CO_2,37℃的环境中可以获得良好的生长。用从微摩尔浓度至毫摩尔浓度的铝处理细胞1小时,细胞死亡率明显增加,并呈剂量依赖性。但10^(-3)mol/L浓度的铝却使死亡率突然降低,与10^(-4)mol/L比较具有极显著的统计学意义。铝的神经毒作用与细胞外液中钙离子存在与否无关,不能用传统的兴奋性学说来解释。

胎鼠海马神经细胞的原代培养及鉴定

目的建立较理想的SD大鼠胎鼠海马神经细胞体外原代培养方法。方法孕18 d(E18)SD大鼠的胎鼠,采用胰酶消化和机械分离相结合的方法进行海马神经元的原代无血清培养。结果在体外培养条件下神经细胞结构特征明显化,并能形成典型的神经细胞网络。结论该培养技术是海马神经细胞体外培养的理想方法。

大鼠海马神经细胞原代培养技术的优化

目的：建立海马神经细胞原代培养技术。方法：取新生1～3d的Wistar大鼠，开颅，迅速分离出海马组织在Hanks中剪碎，加入0．125％胰蛋白酶2mL消化，胎牛血清终止消化，细胞计数后种植于多聚赖氨酸包被的6孔培养板中。结果：神经细胞存活率高，纯度达90％以上，神经细胞生长良好。结论：用此方法能成功获取大鼠海马神经细胞。

SD乳鼠海马神经细胞原代培养方法的探讨

目的寻求一种简单、廉价的原代SD乳鼠海马神经细胞培养方法。方法采用胰蛋白酶消化法制备游离海马神经细胞悬液,进行培养。结果通过多次探索、观察、成功的进行了原代海马神经细胞培养。结论本方法适合一般实验室开展海马神经细胞培养。

大鼠海马神经细胞原代培养及塑料孔板原位鉴定

目的原代培养大鼠海马神经细胞,探讨简单、有效的塑料孔板原位鉴定方法。方法采用Hiroaki等的方法并做了改良,在塑料孔板里进行胎鼠海马神经细胞原代培养,7d后分别用传统和改良的甲苯胺蓝(TB)染色法、改良的神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)染色法对海马神经细胞进行鉴定。结果无血清细胞培养法神经细胞结构特征明显,能形成明显的神经网络结构。传统的TB染色法染色单一,均为淡蓝色;改良的TB染色法红蓝匹配,对比度好;改良的免疫组化NSE染色法胞质阳性。结论无血清培养法是海马神经细胞培养的理想方法,塑料孔板细胞培养原位染色简单易行,对细胞及分子水平研究有重要意义。

乳鼠海马神经细胞的原代培养以及冻存复苏方法

海马神经元作为边缘系统的重要组成部分，在结构上具有高度序化板层结构和神经元相对独立分布等特点，因而成为理想的神经科学研究模型。鼠类出生时的神经元和神经胶质细胞均未分化成熟，最好的脑细胞培养物都来自于临产（21d）的胚胎和新生动物。由于乳鼠的海马较胎鼠好定位，易取材，故多采用乳鼠海马作为实验研究对象㈨。出生1-2d的大鼠数量很难掌握，

原代海马神经细胞体外培养的纯化与鉴定

目的建立原代海马神经细胞体外培养纯化及鉴定的优选方法。方法取新生Wistar乳鼠,分离海马后在体外采用含血清结合无血清法进行培养,并用NSE、GAP-43、MAP2等海马神经细胞特异抗体经免疫细胞化学方法鉴定细胞性质及纯度。结果接种24 h后细胞全部贴壁,并长出突起,随时间增加,突起延长并交错形成网络,至第7-8天神经元形态最为成熟饱满,随后逐渐出现细胞老化,神经元最长可生存4周。经鉴定,海马神经元纯度达96%以上。结论体外采用含血清和无血清法相结合进行原代海马神经细胞培养,细胞纯度高,杂细胞少,可为神经疾病体外研究提供必要细胞基础。

胎鼠海马神经细胞无血清原代培养法及鉴定

目的建立简便的胎鼠海马神经细胞无血清原代培养及纯化方法,为体外研究神经细胞相关模型做准备。方法取E18-19 d的SD孕鼠,分离出胎鼠海马,经机械吹打及0.125%胰酶消化后,台盼蓝计数,DMEM/F12+10%FBS接种于PDL包被的盖玻片上,第2天全量更换为Neurobasal Medium+2%B27,此后每3天1/3~1/2换液,每2天MTT测细胞相对生长率,第8天的细胞用β-ⅢTublin染色做神经细胞鉴定。结果胎鼠海马组织经过0.125%胰酶消化后,台盼蓝计数,可得到92%以上的活细胞。神经细胞体外生长良好。MTT结果显示,培养7~8 d的神经细胞长势最好,细胞核立体感强,轴突联接成网络,可以做神经细胞鉴定。结论此方法培养胎鼠海马神经细胞可以获得长势良好、细胞形态基本一致的、细胞纯度较高的神经细胞,可以作为体外研究神经细胞的良好模型。

携强绿色荧光蛋白重组慢病毒的构建及其在原代培养SD大鼠皮层神经细胞中的表达

目的:构建携带强绿色荧光蛋白的重组慢病毒(Lent/EGFP),感染原代培养SD大鼠皮层神经细胞,观察其感染能力及报告基因的表达水平。方法:采用PCR方法克隆EGFP cDNA;将EGFP基因片段亚克隆到慢病毒穿梭质粒多克隆位点内;用4质粒共转染系统在293ET细胞中包装出携带EGFP基因的重组慢病毒Lent/EGFP;重组病毒感染NIH 3T3细胞,FACS检测重组病毒滴度;Lent/EGFP感染体外培养的原代SD大鼠皮层神经细胞,共聚焦荧光纤维镜观察原代神经细胞内绿色荧光蛋白的表达情况。结果:基因测序证明克隆的EGFP cDNA与GenBank提供的序列完全一致;琼脂糖凝胶电泳结果证实EGFP正确插入pLenti6/V5TOPO;FACS检测病毒滴度为2×106;在体外分离培养的原代SD大鼠皮层神经细胞中,重组病毒感染72 h后可见较强的绿色荧光蛋白表达。结论:采用改良的4质粒共转染方法成功构建了携EGFP的重组慢病毒载体;Lent/EGFP对非分裂的神经细胞具有较强的感染能力,且携带的EGFP基因可以在神经细胞内有效表达。

用微环境小室培养相对单一的海马原代神经细胞

采用我室自己创建的相对恒定微环境小室培养法，对新生大鼠海马进行了原代分离培养。在不用抑制胶质细胞生长的药物情况下，成功地得到了相对单一的神经细胞培养物和单神经元网络，为进一步开展神经生物学研究，提供了很好的体外模型。

小鼠背根神经节神经细胞的原代培养新方法

目的建立一种操作简便、高纯度的小鼠背根神经节神经细胞原代培养的方案。方法取6～8周龄健康雄性C57BL/6小鼠的背根神经节,使用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶消化,获取背根神经节神经细胞,采用小鼠神经元特异性烯醇化酶(NSE)单克隆抗体免疫细胞化学染色鉴定并测定细胞纯度。结果培养的原代神经细胞生长良好,纯度可达90%,用含有神经生长因子(NGF)的DMEM培养基培养,存活时间可达60 d。结论该方案简单稳定,可培养出大量高纯度的神经细胞,为深入研究神经细胞提供了可靠的模型。