新生小鼠小脑颗粒神经元的原代培养与鉴定

目的通过改进已报道的新生小鼠小脑颗粒神经元培养方法,以获得纯度更高,杂质更少,状态更佳的颗粒神经元。方法将小鼠小脑组织剪碎,经木瓜蛋白酶消化后得到单细胞悬液,采用Percoll非连续性密度梯度离心法分离出颗粒神经元前体细胞,种植在基质胶包被过的培养皿中并在培养20 h后给予阿糖胞苷(5μmol/L)处理8h。使用激光共聚焦显微镜及神经元特异性标志物微管相关蛋白2(MAP2)对小脑颗粒神经元细胞进行纯度鉴定。结果细胞存活率达98.03%±1.048%;神经元纯度为99.71%±0.2%。结论该方法获取的颗粒神经元存活率和纯度较高,是一种小鼠小脑颗粒神经元体外培养的可靠方法。

SD大鼠乳鼠原代皮质神经元和小胶质细胞同时提取并培养的实验方法

背景:原代皮质神经元和小胶质细胞在探索神经系统疾病细胞疗法中起着至关重要的作用,而目前获得2种细胞的方法大多较繁琐,需分别单独提取。因此找到一种便捷、快速可同时提取2种细胞的方法十分关键。目的:探索一种新型同时提取原代皮质神经元及小胶质细胞的方法。方法:取24 h内新生SD大鼠乳鼠,将大脑取出放入装有DMEM的培养皿中,去除软脑膜后备用。同一脑组织,先提取原代神经元,再将剩余脑组织用于提取小胶质细胞,整个过程在冰上操作。原代皮质神经元提取培养步骤:镊子夹取2.0-3.0 mm厚度大脑皮质组织置于培养皿,用木瓜蛋白酶消化20 min,中止消化后吹打组织呈互相粘连的组织悬液,吸上清细胞悬液,过滤、分装到15 mL离心管中,离心并重悬后将细胞接种于左旋多聚赖氨酸包被的6孔板爬片上放入细胞培养箱,每隔1 d观察神经元形态,第7天进行MAP2和β-Tubulin免疫荧光染色鉴定。小胶质细胞提取培养步骤:夹取上一步取皮质后剩余脑组织,厚度8-10 mm,置于培养皿,用胰酶消化20 min,中止消化后吹打组织呈匀浆,然后将匀浆转移到培养瓶中培养,第14天将培养瓶封口后进行恒温水平摇床振荡2 h,小胶质细胞脱落于上清中;取纯化后的小胶质细胞继续培养3 d进行Iba1免疫荧光染色鉴定。结果与结论:(1)神经元培养24 h后贴壁、胞体变大,部分神经元长出突触;培养到第3,5天时胞体进一步增大,大部分神经元已呈突触形态,部分神经元成团生长;第7天时,神经元突触延长增粗并互相连接成网。经β-Tubulin、MAP2免疫荧光染色鉴定为神经元。(2)小胶质细胞培养第1天换液后可见细胞贴壁生长;第3,5,7天时细胞密度均较小,细胞形态呈高亮椭圆或圆形,但已基本成团块状生长于其他细胞上层;第10天时小胶质细胞密度明显增大;第14天时小胶质细胞呈致密团块状生长于其他细胞上层,此时可进行分离纯化。取分离纯化后细胞再培养至第3天,经Iba1免疫荧光鉴定为小胶质细胞,且纯度大于95%。(3)结果表明,经此法提取并培养获得的原代皮质神经元和小胶质细胞纯度高、形态好、成活率高。

一种低密度及高纯度胎鼠原代海马神经元培养方法的优化及鉴定

目的通过将海马、皮层细胞共培养的方式建立一种低密度、高纯度、高稳定性的大鼠胎鼠原代海马神经元体外培养方法,以获取纯度更高、活力更好的原代海马神经元。方法分离孕16~18 d SD大鼠胎鼠的海马和皮层并分别剪碎,经0.125%胰蛋白酶消化后用200目细胞筛过滤,将获得的细胞悬液以包围的形式分别接种于培养板的内层和外环上,于含10%马血清的DMEM/F12培养基中进行共同培养,4~6 h细胞贴壁后更换培养基为维持培养基培养(Neurobasal培养基+2%B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺)。通过CCK-8试剂盒检测细胞活力,利用免疫荧光染色检测海马神经元纯度。结果海马神经元在5 d后形成纵横交错的神经网络,生长状态较好,经鉴定海马神经元的纯度高达98%,且能够稳定存活3周。结论利用海马、皮层细胞共培养的方法可以获取高纯度、高活性、高存活率、高稳定性的胎鼠原代海马神经元,可为神经系统中海马神经元相关疾病研究提供一定的实验条件。

胎鼠原代脊髓神经元分离培养方法的改良

目的:介绍一种改良原代胎鼠脊髓神经元的分离培养方法.方法:取育龄期雄、雌SD大鼠各36只,合笼配种怀孕.取受孕10~12d、13~15d及16~18d的SD大鼠各6只,解剖分离胚胎脊髓,按常规胰酶消化法制备单细胞悬液,应用细胞计数板及台盼蓝染色,在显微镜下数出蓝色细胞数和细胞总数,计算细胞存活率,明确最佳取材胎龄;接着以上述最佳取材胎龄为取材时间点,每组6只孕鼠,按无酶法、胰酶法和Accutase酶法消化三种不同的方法制备单细胞悬液,显微镜下数出蓝色细胞数和细胞总数,计算细胞存活率.接种、纯化细胞并培养1、3、7d后,用倒置相差显微镜观察脊髓神经元生长状态,利用神经元特异性标志物βtubulinⅢ与细胞核双标记法鉴定培养脊髓神经元的纯度.结果:孕13~15d组细胞总量和存活细胞量高于孕10~12d组,细胞存活率高于孕16~18d组(P<0.05).Accutase酶组获取的细胞总量、存活细胞量以及细胞存活率均明显高于常规无酶组及胰酶组(P<0.05).在倒置相差显微镜下观察发现,脊髓神经元培养7d后,胞体周围逐渐出现光圈,神经突起逐渐伸长,最终形成密集的神经突起网络;与无酶组及胰酶组相比,Accutase酶法分离的脊髓神经元分布更加均匀并且神经突起形成的网更密集.经βtubulinⅢ和hoechst33342荧光染色鉴定,Accutase酶组、无酶组及胰酶组三组分离提取培养的脊髓神经元纯度分别为(90.29±2.55)%、(83.51±6.20)%和(88.10±4.07)%,组间无统计学差异(P>0.05).结论:13~15d胎龄是原代培养脊髓神经元的最佳取材时间;Accutase酶法相较于常规无酶法、胰酶法所获取的脊髓神经元产量更大、生长状态更好,可作为体外研究脊髓神经元病变的细胞模型.

新生SD大鼠大脑皮质神经元的原代培养及鉴定

背景:培养神经元的质量是研究中枢神经系统疾病的关键所在,但培养方法一直没有统一的标准。目的:探究取材部位及阿糖胞苷处理对原代培养神经元活性、纯度及成熟度的影响。方法:选取新生24 h内的SD乳鼠,取大脑皮质表面2.0-3.0 mm处细胞,培养后24,48,72 h,用5μmol/L或10μmol/L阿糖胞苷处理48 h;另取全部大脑皮质细胞,培养后48 h用5μmol/L阿糖胞苷处理48 h。培养至第7天,倒置显微镜下观察细胞形态,采用CCK-8法检测阿糖胞苷对神经元活性的影响,免疫荧光和Western blot检测神经元的纯度及成熟度。结果与结论:①倒置显微镜:10μmol/L阿糖胞苷24,48,72 h组神经元密度分别低于同时间下的5μmol/L阿糖胞苷组,该6组神经元突起相互之间均可连接成紧密的网状结构,神经元胞体丰满并充满折光特性;全皮质组细胞密度低于正常对照组,并可明显观察到非神经元;②CCK-8检测:各阿糖胞苷组细胞活性均低于正常对照组(P<0.001),10μmol/L阿糖胞苷24,48,72 h组神经元活性低于同时间下的5μmol/L阿糖胞苷组(P<0.05),5μmol/L阿糖胞苷24 h组神经元活性低于5μmol/L阿糖胞苷48,72 h组(P<0.01);③免疫荧光染色:各阿糖胞苷组神经元纯度大于正常对照组、全部皮质组(P<0.001),各阿糖胞苷组神经元纯度无差异;④Western blot检测神经元特异性烯醇化酶蛋白表达:各阿糖胞苷组神经元成熟度高于正常对照组(P<0.05),其中以5μmol/L阿糖胞苷48 h组成熟度最高;⑤结果表明:取新生24 h内大鼠大脑皮质表面2.0-3.0 mm处皮质,培养后48 h加入5μmol/L阿糖胞苷处理得到的神经元活性、成熟度和纯度较好。

小鼠原代海马神经元培养方法优化及HT22-GRK2^(-/-)细胞构建

目的 探究并优化新生小鼠海马神经元体外原代培养方法;构建小鼠海马神经元HT22细胞中G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)基因敲除细胞株(HT22-GRK2^(-/-))。方法 为优化小鼠原代海马神经元的培养,取新生1~2 d C57BL6/J小鼠海马组织,经胰酶消化后吹打形成细胞悬液,于Neurobasal-A培养基中加细胞培养添加剂维持细胞生长。利用CRSIPR/Cas9基因编辑技术构建HT22-GRK2^(-/-)细胞株,并通过免疫荧光染色和Western blot检测GRK2敲除效率。结果 以3×10^(7)/孔密度接种的新生小鼠原代海马神经元以无血清培养方式接种于6孔板中,可获得纯度高、活性好的小鼠原代海马神经元细胞;HT22-GRK2^(-/-)细胞株构建成功。结论 成功建立并优化小鼠海马神经元体外原代培养方法,利用CRSIPR/Cas9基因编辑技术成功构建HT22-GRK2^(-/-)细胞株。

阿糖胞苷对原代培养的大鼠海马和大脑皮层神经元生物学特性的影响

目的:探讨阿糖胞苷(Ara-C)不同浓度、不同介入时间以及不同处理时长对原代培养的大鼠海马和大脑皮层神经元纯度及活性的影响。方法:取孕16~18 d的胎鼠海马及皮层组织进行原代神经元培养,培养后48 h分别加入浓度为0、2.5、5、7.5、10μmol/L的Ara-C处理24 h,检测不同浓度的Ara-C对原代神经元生物学特性的影响;培养后24、48、72、96及120 h,加入5μmol/L的Ara-C处理24 h,检测Ara-C不同介入时间对原代神经元生物学特性的影响;培养后48 h,加入5μmol/L的Ara-C处理0、6、12、24、48 h,检测Ara-C不同处理时长对原代神经元生物学特性的影响。培养后第8天倒置显微镜下观察细胞的形态及生长状况,免疫荧光检测微管相关蛋白2(MAP2)、神经纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,并计算MAP2阳性细胞占细胞总数的比例。使用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测神经元细胞活性。结果:与对照组(0μmol/L)相比,Ara-C浓度为5μmol/L组海马神经元纯度达89.8%、细胞活性为48.6%。与对照组相比,种板后48 h加入Ara-C获得的海马神经元纯度为96.2%,细胞活性为44.8%。与对照组(0 h)相比,Ara-C处理12 h组获得的海马神经元的纯度为90.8%,细胞活性为47.5%。在大鼠原代培养的皮层神经元中,与对照组(0μmol/L)相比,给予不同浓度的Ara-C(2.5、5、7.5、10μmol/L)处理,原代皮层神经元纯度的差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,给予不同介入时间(24、48、72、96、120 h)的Ara-C处理,皮层神经元纯度的差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组(0 h)相比,给予不同时长(6、12、24、48h)的Ara-C处理,仅Ara-C处理24 h后皮层神经元纯度稍增高(P<0.05)。结论:在大鼠原代海马神经元的早期培养过程中,种板后48 h加入5μmol/L Ara-C处理12 h得到的海马神经元的纯度与活性最佳,而在大鼠原代皮层神经元培养中无需添加Ara-C即可获得较高纯度和活性的神经元。

一种同时培养原代皮质及海马神经元的实验方法

背景:近年来原代神经元细胞模型在颅脑疾病中扮演着重要的角色,此类细胞模型特性更加贴近于疾病细胞,可用于模拟研究各类神经系统疾病。目的:建立一种便捷实用的可同时提取皮质及海马原代神经元的培养方法。方法:取新生24 h内的SD大鼠,麻醉后断脊法处死,采用体积分数为75%乙醇消毒,用镊子分离出颅骨及脑膜,解剖出完整大脑,剥离脑血管膜,游离出大脑皮质及海马组织,采用木瓜蛋白酶及适量DNA酶顺序消化方案,吹打、离心、过滤,然后接种于左旋多聚赖氨酸包被的6孔板和爬片内,以含体积分数10%胎牛血清的DMEM-F12培养基为种植液,6 h后换用含有B27的Neurobasal无血清专用培养基,持续培养7 d后,显微镜下观察细胞形态及生长状态。分别采用β-Tubulin免疫荧光法、Neun抗体免疫组化法鉴定皮质神经元与海马神经元,以及采用MAP2免疫荧光法鉴定其纯度。结果与结论:①接种24 h后细胞体积变清晰,呈不规则圆形、周围环绕光晕,少数细胞已有细小突起,均已贴壁生长;持续培养3 d后,胞体逐步增大,部分呈聚团性生长,突触延长,细胞间出现交联;持续培养7 d后,胞体成熟饱满,细胞质显著增多,光晕增强,形成更为密集的神经元网络;②经Neun抗体免疫组化法、β-Tubulin免疫荧光法鉴定为神经元,神经元标志物MAP2免疫荧光法鉴定皮质神经元和海马神经元纯度分别为(94.00±0.34)%和(91.00±0.26)%,可用于后期实验;③结果表明,采用同一批24 h内新生SD大鼠分离大脑皮质和海马组织,经木瓜蛋白酶与DNA酶顺序消化后,可提取到优质的海马神经元及皮质神经元。该方案得到的神经元纯度高,操作简化,可作为研究各类神经系统疾病细胞模型的基础。

SD乳鼠原代皮质神经元及星形胶质细胞同时培养的实验方法

背景:目前获取原代皮质神经元和星形胶质细胞的方法很多,传统方法通常是分别获取这两种细胞,但实验方法过于繁琐且浪费实验材料。找到一种简单、经济、可行并同时提取这两种细胞的培养方法尤为重要。目的:观察同时提取培养SD乳鼠大脑皮质神经元及星形胶质细胞的效果及注意事项。方法:选用出生24 h内的SD乳鼠,用体积分数为75%乙醇浸泡消毒,待乳鼠昏迷后断脊处死,沿乳鼠颈部用剪刀离断头颅并放入装有高糖DMEM的小烧杯中,沿矢状缝打开头颅并取出大脑放入盛有高糖DMEM的培养皿中。在冰上剥出脑膜及血管,夹取皮质表面2.0-3.0 mm的脑组织,通过木瓜酶和DNA酶进行消化20 min,用含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化。以细胞浓度为1.0×10^(9) L^(-1)种植于含有爬片(用多聚赖氨酸处理)的6孔板中,分别于1,3,5,7 d通过倒置荧光显微镜下观察神经元的形态变化,使用Calcien-AM进行活细胞染色观察细胞活性,β-Tubulin、MAP2免疫荧光染色对神经元进行鉴定。将剩余大脑皮质进行星形胶质细胞的提取,经过胰酶消化、过滤、吹打,以适宜的浓度接种于培养瓶中,待细胞融合度达到90%时,进行恒温水平摇床振荡24 h以纯化星形胶质细胞。当细胞传代纯化后以1.0×10^(9) L^(-1)接种于6孔板中培养,GFAP免疫荧光染色对星形胶质细胞进行鉴定。结果与结论:①培养1 d后可见神经元贴壁生长,胞体增大,部分聚集生长,细胞间有少量的突触连接;培养3,5 d后胞体进一步增大,突触增粗伸长相互连接;培养7 d后神经元明显聚集,突触增长增粗,相互连接形成致密的细胞网。Calcien-AM活细胞染色可见神经元活性较好,经β-Tubulin、MAP2免疫荧光鉴定细胞纯度大于90%。②培养3 d后星形胶质细胞胞体增大,呈现梭状、不规则状,细胞间出现少量相互连接,细胞间存在较多小胶质细胞;培养5 d后胞体、突起进一步增大;培养7 d发现细胞间的小胶质细胞及其他杂质明显减少,背景较为干净。经GFAP免疫荧光鉴定细胞纯度大于95%。③此方法获得的皮质神经元和星形胶质细胞形态好、杂质少、纯度高,可满足神经科学研究对高纯度的皮质神经元及星形胶质细胞的需求。

甲基苯丙胺对原代培养大鼠海马和纹状体神经元神经肽S受体表达的影响

目的探讨甲基苯丙胺(去氧麻黄碱,METH)处理原代培养的大鼠海马和纹状体神经元对神经肽S受体(NPSR表达的影响。方法取SD胎鼠(胎龄18 d)海马和纹状体神经元原代培养10 d,分别随机分为4组:正常对照组、METH(1、4和16mmol/L)组。给药24 h后,使用显微镜观察纹状体和海马神经元的形态学改变;Western印迹法和免疫荧光法测定海马和纹状体神经元内NPSR表达水平,并分析各组间NPSR表达水平的差异。结果正常对照组和METH 1 mmol/L组的纹状体、海马神经元胞体饱满,透光性好,细胞膜表面平滑光整,与细胞外液的边界清晰,神经元有数条神经突起伸出,互相连接,形成网络结构。与正常对照组相比,METH 4和16 mmol/L组的海马和纹状体神经元胞体萎缩,突起变短、断裂甚至消失,网络结构基本消失,细胞脱壁漂浮增加。Western印迹法检测结果表明,与正常对照组相比,METH 4和16 mmol/L组纹状体神经元NPSR表达显著减少(P<0.05),海马神经元NPSR表达显著减少(P<0.01,P<0.05)。免疫荧光法测定结果发现,与对照组相比,METH 4和16 mmol/L组纹状体和海马神经元NPSR平均光密度显著减少(P<0.01,P<0.05;P<0.01,P<0.05)。Western印迹法和免疫荧光法结果一致。结论 METH可抑制大鼠海马和纹状体中NPSR的蛋白表达。

大鼠海马神经元neurobasal无血清的原代培养方法

目的：建立纯度和活力较高的无血清原代培养海马神经元的方法。方法：新生SD大鼠海马，用neurobasal培养基培养，免疫荧光鉴定神经元纯度，MTT法检测其活力。结果：神经元接种12～24h后贴壁，并长出细小突起，3d具有典型神经元形态特征，4d突起形成稀疏的神经纤维网络，8d后神经元5～10个聚集成团，突起密集，生长稳定，12d后出现细胞碎片。Tubulin荧光染色显示清晰的神经元，突起绵长且相互交织，占细胞总数的66．7％；GFAP荧光染色的细胞数量少，突起短粗，占33．7％。培养1～5d MTT代谢率逐渐上升，6～11d处于平台期，11d后下降。结论：neurobasal无血清培养获得的神经元纯度大于60％，6～11d的细胞适于细胞学实验。

新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定

采用倒置相差显微镜、环境扫描电子显微镜对新生24h内SD大鼠大脑皮质原代培养的神经元进行了形态学观察，建立了大脑皮质神经元原代培养方法。应用2．5μg／mL阿糖胞苷（Ara-C）对培养3d的神经元进行24h干预，去除神经胶质细胞、成纤维细胞、神经干细胞等杂质细胞，以提高神经元产率；用Nissl’s染色法进行神经元鉴定；利用微量滴定（MTT）法测定了一个培养周期（约10d）的神经元活性分布。光学显微镜观察结果表明，培养至第4h绝大多数神经元已贴壁生长，胞体上可见1～2个细小突起；培养至第3d、第6d时，Nissl’s染色结果显示，加Aralc能显著提高神经元纯度（≥929／6）；MTT结合形态学观察结果表明，神经元培养至第6d时活性最强，细胞呈卵圆形、蜘蛛状、锥体状等多种形态，细胞胞体饱满，光晕明显，神经网络形成完整。

一种原代培养大鼠DRG神经元的新方法

目的建立并提供一种可供客观衡量和评价实验研究结果的稳定、高效的体外原代神经细胞的培养模型。方法采用神经细胞专用无血清培养基——Neurobasal作为培养介质,用喜树碱纯化DRG神经元培养体系,通过对背根神经节分离、细胞培养以及纯化等多个环节和步骤的比较研究,确定了DRG神经元原代培养和纯化的最佳条件和步骤。结果采用上述方法,可获得具有良好活性的高纯度原代DRG神经元(>98%)。结论该培养体系稳定可靠、适用于生物学和药理学等相关的体外实验研究。

皮质神经元B27原代培养及MAP2鉴定

目的对原代新生鼠皮质神经元原代培养方法进行改进,以获得纯度更高、体外更易存活的神经元进行相关实验研究。方法采用胰酶消化和机械分离相结合的方法制备皮质神经元悬液,进行培养,用倒置相差显微镜观察细胞形态,利用神经元特异性标志物微管相关蛋白2(MAP2)鉴定培养神经元的纯度。结果神经元细胞存活率高,在体外培养条件下细胞状态良好,生长旺盛。培养第4天,可见多数细胞长出1、2个突起并交织成网。培养第8天细胞胞体较大,能形成典型的神经细胞网络。培养第10天,鉴定神经元纯度质量分数达90%以上。结论该方法简便可行,是体外培养神经元较理想的方法。

新生大鼠海马神经元原代无血清培养与鉴定

目的建立一种简单、易行的海马神经元无血清体外培养方法以获得高纯度、高活力的海马神经元。方法取新生24 h内SD大鼠,分离海马,经消化后种植于包被有Matrigel基膜的玻片上,24 h后换含有N2、B27的Neuro-basal无血清培养基,于不同时间在倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态;采用β-tublinⅢ免疫荧光细胞化学技术鉴定海马神经元纯度。结果大部分海马神经元于3～24 h贴壁且可长出细长突起,3 d细胞具有典型神经元的形态特征,5d后神经元突起进一步增多并形成稠密的网络连接,7 d后神经元胞体丰满,趋于成熟。经β-tublinШ免疫荧光技术鉴定纯度为94.2%±3.6%。结论此方法简单有效,可获得高纯度的海马神经元。

大鼠皮层神经元原代培养、鉴定及氧糖剥夺模型的建立

目的原代培养和鉴定大鼠皮层神经元,并建立大鼠皮层神经元氧糖剥夺(OGD)模型。方法采用酶消化法和机械分离法相结合进行大鼠神经元原代培养,采用抗NSE免疫细胞化学染色鉴定,应用缺氧D-Hank液及缺氧培养罐行OGD,台盼蓝染色及LDH漏出率检测细胞损伤程度。结果神经元培养至第6天,NSE染色阳性细胞为86.32%±2.64%;神经元经不同时长的OGD处理后,台盼蓝染色呈现不同形态;OGD60min时,神经元LDH漏出率较对照组明显增加(P<0.05)。结论成功完成大鼠皮质神经元原代培养,神经元在培养第6天可用于模型制备,成功建立神经元OGD模型。

阿糖胞苷对大鼠海马神经元原代培养的影响

目的:探讨在大鼠海马神经元原代培养过程中,阿糖胞苷对培养神经元的影响。方法:将新生24 h大鼠,分离出海马组织,进行原代海马神经元培养,再将细胞分为阿糖胞苷组和对照组,阿糖胞苷组加入1μmol/L阿糖胞苷,通过检测神经元特异性标志物微管相关蛋白-2(Map-2)计算培养神经元的数量,通过台盼蓝染色法观察细胞的存活率。结果:培养第7天,阿糖胞苷组神经元数量为(11±3)个,对照组为(10±4)个,两组无明显差异;阿糖胞苷组神经元细胞在培养第14天时存活率为74%,培养第21天时存活率为49%,而对照组神经元14天时存活率为96%,21天存活率为88%,两组神经元存活率差异明显。结论:原代培养海马神经元时,阿糖胞苷对神经元产量及形态影响不明显,但是由于阿糖胞苷的毒性作用,明显缩短神经元的存活时间,影响长期培养神经元的存活率。

电磁辐射对原代培养海马神经元的损伤效应及其机制探讨

研究X带高功率微波、S带高功率微波及电磁脉冲辐射对原代培养海马神经元的损伤效应并探讨其机制。通过体外培养原代海马神经元,建立电磁波辐照细胞模型。采用Annexin V-PI双标记、流式细胞术检测细胞凋亡与坏死,原子力显微镜检测细胞膜表面形态,Fluo-3-AM荧光探针负载、激光扫描共聚焦显微镜测定胞内[Ca2+]i。结果表明,辐射后海马神经元凋亡与坏死均增加,其中坏死增加明显;细胞膜表面粗糙度加大,膜穿孔增多;胞内[Ca2+]i明显升高。且以上变化均以X带高功率微波组最重,S带高功率微波组次之,电磁脉冲组最轻。提示细胞膜穿孔增多,膜通透性增加,导致胞外Ca2+内流增加,甚至胞内钙超载是辐射致海马神经元凋亡与坏死的机制之一;三种电磁辐射对海马神经元的损伤程度与照射频率呈正相关。

胶质细胞成熟因子支持原代培养的小脑皮质神经元的生存

胶质细胞成熟因子(GMF)是从成年牛脑中提取的一种酸性蛋白质,它能可逆地促进成星形胶质细胞形态和化学的分化。我们现在建立富含神经元的生后7天大鼠小脑皮质分离细胞原代培养物,间接免疫荧光染色分类计数证明,该原代培养物中神经元占细胞总数的97%,其中绝大部分是颗粒细胞。加纯化的 GMF 在此培养物,可明显促进神经元的生存;而不加 GMF 的对照培养物,神经元的数目明显减少。纯化 GMF 的这种作用与其剂量有关,最适的刺激剂量浓度为250 ng/ml。虽然对 GMF 影响小脑皮质神经元生存的机制尚不清楚,但实验结果提示,GMF 的功能不只限于对胶质细胞,它在中枢神经系统内,也可能是一种对神经元起神经营养作用的生长因子。