沉默YTH结构域家族蛋白2改善血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠原代心肌细胞肥大与凋亡

目的探讨YTH结构域家族蛋白2(YTHDF2)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的新生大鼠原代心肌细胞肥大和凋亡的影响。方法为探讨AngⅡ刺激下YTHDF2的表达水平,将细胞分为正常组和AngⅡ组。为探讨沉默YTHDF2对心肌细胞肥大与凋亡的影响,将细胞分为4组,空白组[转染阴性对照小干扰RNA(siRNA)+PBS]、siYTHDF2组[转染YTHDF2 siRNA(siYTHDF2)+PBS]、模型组(siRNA+AngⅡ)和实验组(siYTHDF2+AngⅡ)。用Western blot和逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测YTHDF2基因表达水平,RT-qPCR检测心肌肥厚相关基因心房钠尿肽(ANP)、B型钠尿肽(BNP)和β肌球蛋白重链(β-MHC)及心肌细胞凋亡相关基因Bax、B淋巴细胞瘤2基因(Bcl-2)mRNA的表达水平,免疫荧光染色观察心肌细胞表面积,原位末端标记法染色观察心肌细胞凋亡情况,免疫沉淀反应验证YTHDF2和Bcl-2的结合关系。结果AngⅡ组YTHDF2蛋白表达及mRNA水平显著高于正常组(1.49±0.03 vs 0.97±0.09,1.50±0.08 vs 1.00±0.07,P<0.05)。与空白组比较,模型组心肌细胞表面积增大,细胞凋亡率升高,ANP、BNP、β-MHC、Bax mRNA表达明显升高,Bcl-2 mRNA表达明显降低(P<0.05)。与模型组比较,实验组心肌细胞表面积减小,细胞凋亡率降低,ANP、BNP、β-MHC、Bax mRNA表达明显降低,Bcl-2 mRNA表达明显升高(P<0.05)。结论沉默YTHDF2可以缓解AngⅡ诱导的大鼠原代心肌细胞肥大与凋亡,YTHDF2通过与Bcl-2相结合抑制其表达水平。

视黄醇结合蛋白1通过激活TAK1促进大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大

目的:探究视黄醇结合蛋白1(retinol binding protein 1, Rbp1)在大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大中的功能和机制。方法:本研究通过联合分析基因表达数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)中的小鼠心肌肥厚基因芯片数据,寻找在心肌肥厚发生过程中的关键调控因子,构建该基因过表达及敲减腺病毒并感染大鼠乳鼠原代心肌细胞,利用血管紧张素II(angiotensin II, Ang II)诱导大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大模型,研究目的基因对大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大的影响,应用Western blot及RT-qPCR探究目的基因调控大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大的分子机制。结果:在小鼠心肌肥厚心脏组织中Rbp1的表达显著上调(P<0.01),体外细胞实验显示与对照组相比,Rbp1过表达组的大鼠乳鼠原代心肌细胞面积显著增大,心肌肥厚标志基因心钠肽(atrial natriuretic peptide, Anp)和肌球蛋白重链7(myosin heavy chain 7, Myh7)的表达显著升高(P<0.01),证实Rbp1过表达能促进Ang II诱导的大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大;相反,Rbp1敲减则能显著抑制Ang II诱导的大鼠乳鼠原代心肌细胞面积增加和心肌肥厚标志物表达。机制研究显示,Rbp1过表达显著激活转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1, TAK1)和P38(P<0.01),应用TAK1抑制剂可阻断Rbp1过表达对Ang II诱导大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大的促进作用。结论:Rbp1可通过激活TAK1信号通路促进Ang II诱导的大鼠乳鼠原代心肌细胞肥大。

高糖环境下法舒地尔调控自噬对原代心肌细胞凋亡的作用

目的探讨高糖环境下,法舒地尔对原代心肌细胞凋亡的作用及自噬在其中的作用。方法分离培养原代心肌细胞,使用不同葡萄糖浓度培养基培养细胞,并使用法舒地尔及3-MA干预。检测细胞凋亡,测定Bcl-2、Bax、MYPT-1、p-MYPT1、LC3、P62等蛋白的表达,并检测ROCK1和ROCK2的mRNA表达量。结果高糖环境下,原代心肌细胞凋亡比例升高,Bcl-2表达下降、Bax表达增多,ROCK1、ROCK2 mRNA表达增加,p-MYPT1/MYPT1比值降低;法舒地尔可抑制高糖环境下原代心肌细胞凋亡比例,Bcl-2升高、Bax水平降低,ROCK1、ROCK2 mRNA表达减少、p-MYPT1/MYPT1比值降低。高糖环境下不可溶性P62表达增多;法舒地尔干预后,不可溶性P62蛋白表达减少、可溶性P62蛋白表达增多、同时LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增大。在法舒地尔干预基础上应用自噬流抑制剂3-甲基腺嘌呤,可见到细胞凋亡比例升高、Bcl-2下降及Bax水平的升高、不可溶性P62表达增多(P<0.05)。结论高糖环境下,法舒地尔通过活化自噬流抑制原代心肌细胞凋亡。

瓜蒌皮水提物通过PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制缺血缺氧大鼠原代心肌细胞的凋亡

以激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路、抑制心肌细胞凋亡为切入点,探究瓜蒌皮水提物(TP-W)保护心肌缺血的机制.分离大鼠心肌细胞,通过缺氧气体+无血清培养液培养制造缺血缺氧损伤模型,以模拟急性心肌缺血时的体内心肌细胞环境;同时添加PI3K特异性抑制剂(LY294002)和TP-W处理细胞,利用倒置相差显微镜观察细胞形态,噻唑兰法、末端标记法分别检测细胞存活率及凋亡率,免疫荧光联合免疫印迹方法定位、定量地检测细胞内PI3K、Akt及eNOS蛋白表达及磷酸化水平.结果显示:对上述缺血缺氧损伤的心肌细胞,TP-W可显著改善其生长状态、提高存活率、降低凋亡率;同时显著上调上述3种蛋白表达水平及磷酸化水平,但磷酸化水平均可被LY294002处理显著削弱.可见,激活PI3K/Akt/eNOS信号通路、抑制心肌细胞凋亡可能是TP-W抗心肌缺血的重要机制,也是中药“开胸除痹”的关键生物学内涵.

原代心肌细胞损伤模型研究进展

原代心肌细胞(PCMs)作为心血管研究的基础,能在体外真实有效地反映体内心脏生理活性和病理特征,包括不同信号转导通路激活、代谢途径异常、酶系统变化、相关基因表达改变等。再者,因PCMs具备经济易得、直观、重复性好等优势,在心血管疾病病理发生、药理研究及新药发现中应用广泛。目前,心血管疾病所伴随的心肌损伤复杂多样,形成机制各不相同,构建原代心肌细胞不同损伤模型,占据着极为重要的部分。本文将对原代心肌细胞氧化应激模型、缺氧/复氧损伤模型、肥大损伤模型以及病毒性心肌炎模型这四类模型研究情况进行如下综述,为原代心肌细胞损伤模型在心血管疾病研究中的应用和发展提供基础性参考。

参附益心方对缺氧原代心肌细胞活性氧和能量代谢的影响

目的:观察参附益心方对缺氧原代心肌细胞活性氧(ROS)和能量代谢的影响。方法:新生SD大鼠原代心肌细胞经分离、培养、鉴定后,随机分为正常组、模型组、阳性对照组(辅酶Q_(10),0.1 mmol/L)和参附益心方低、高剂量组(0.25、0.5 mg/mL)。除正常组外,其余各组细胞均于5%O_2、5%CO_2、90%N_2条件下培养6 h以复制缺氧损伤模型。缺氧6 h后,采用ROS探针和流式细胞术分别检测各组细胞及其线粒体中ROS的含量,采用荧光素酶发光法和Western blotting法分别检测各组细胞中腺苷三磷酸(ATP)的含量以及肌酸激酶(CK)蛋白的表达水平,并使用透射电子显微镜观察各组细胞的超微结构。结果:与正常组比较,模型组缺氧原代心肌细胞及其线粒体中ROS的表达均明显增加,其ROS含量均显著升高,ATP的含量以及CK蛋白的表达水平均显著降低(P<0.05);细胞内质网、线粒体肿胀,线粒体嵴溶解甚至消失,损伤明显。与模型组比较,各给药组缺氧原代心肌细胞及其线粒体中ROS的表达均有所减少,阳性对照组和参附益心方高剂量组缺氧原代心肌细胞中ROS的含量以及各给药组缺氧原代心肌细胞线粒体中ROS的含量均显著降低,阳性对照组和参附益心方高剂量组缺氧原代心肌细胞中ATP的含量以及各给药组缺氧原代心肌细胞中CK蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05);阳性对照组和参附益心方高剂量组缺氧原代心肌细胞损伤明显减轻。结论:参附益心方对缺氧原代心肌细胞具有一定的改善作用,可下调细胞及线粒体中ROS的表达,并可改善其能量代谢。

新生大鼠原代心肌细胞分离方法的改进

目的对传统的原代乳鼠心肌细胞分离方法进行改良,获得活性好、纯度高、反应性好的原代乳鼠心肌细胞。方法利用断头开胸取心法取新生24 h内的Wistar大鼠心肌组织,无菌剪碎后用0.25%不含EDTA胰酶混合II型胶原酶消化法,采用自制消化组合装置分离消化细胞。逐日在倒置相差显微镜下观察细胞状态。采用心肌细胞特异性蛋白α-横纹肌肌动蛋白（α-actin）单克隆抗体对培养的心肌细胞进行免疫荧光鉴定。另外使用异丙肾上腺素和去甲肾上腺素作用于细胞,观察细胞反应情况。结果培养后24 h即可观察到部分细胞搏动,可初步确定为心肌细胞;48 h后细胞逐渐展开,连续观察20 d,发现心肌细胞在3～14 d期间搏动频率与形态无明显变化。对比观察发现断头开胸取心法获取的原代心肌细胞中红细胞数量明显减少。免疫荧光鉴定发现,本方法获得的心肌细胞纯度高达95%。此外,分离的原代乳鼠心肌细胞对异丙肾上腺素和去甲肾上腺素反应灵敏。结论断头开胸取心法配以混合酶液消化心脏组织分得的原代乳鼠心肌细胞反应性好、纯度高、有活力,可满足大多数实验的要求。

胶原海绵复合新生大鼠原代心肌细胞构建工程化心肌组织

目的:探索以胶原海绵为支架、新生大鼠原代心肌细胞为种子细胞,于体外构建工程化心肌组织的方法。方法:实验于2005-12/2006-11在解放军第四军医大学西京医院心内科实验室完成。Ⅰ型胶原海绵剪切成方形片状(2.0cm×1.4cm×0.2cm),经60Co照射消毒,于DMEM培养液中水化1h左右。另取1d龄SD大鼠心脏,剪成小碎块,然后用2.5g/L胰蛋白酶于37℃中消化,吸取上清至含胎牛血清的DMEM中,重复消化四五次,用差速贴壁法除去大部分成纤维细胞,将细胞沉淀用DMEM培养液以2×109L-1的密度悬浮备用。将上述的心肌细胞悬液1mL缓慢滴注于玻璃模型中的胶原海绵上,然后置于细胞培养中培养。肉眼及显微镜主要观察工程化心肌组织在培养期间的自发收缩情况,包括收缩的部位、强度、频率、一致性以及收缩随时间变化的情况。苏木精-伊红染色观察工程化心肌组织内胶原纤维的变化,细胞形态,胞核的形状及细胞之间的连接。免疫组织化学染色和透射电镜观察工程化心肌组织片的形态和功能。结果:①细胞接种于胶原海绵上1d后,细胞/胶原复合物的凝胶化过程基本完毕,体积保持恒定,维持至培养结束,第3天细胞/胶原复合物局部出现点片状自发收缩,第5天整个细胞/胶原复合物出现同步化自发收缩,收缩频率61～199次/min。2周后37.5%的工程化心肌组织的自发收缩活动减弱,但75%的工程化心肌组织的自发收缩活动持续至培养结束。②苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色和透射电子显微镜显示,工程化心肌组织内细胞间连接广泛存在,细胞多呈纵向分布,胞核呈长圆形,胞浆内α-肌节肌动蛋白阳性,胞内肌原纤维排列整齐,可见到心肌特异性的肌小节结构和Z线,多数细胞具有分化的心肌细胞表型。结论:用新生大鼠原代心肌细胞为种子细胞、以Ⅰ型胶原海绵为支架材料,构建出的工程化心肌组织,于体外可长时间持续自发收缩,该细胞/胶原复合物的形态结构与生理功能均类似于成熟大鼠心肌组织。

改良法分离培养SD新生乳鼠原代心肌细胞

目的:建立一种稳定、快速的SD新生乳鼠原代心肌细胞分离培养改良方法。方法:取SD新生乳鼠心室,0.12%Ⅱ型胶原酶消化,Percoll密度梯度离心结合5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)化学抑制法纯化心肌细胞,体外培养于含5%马血清的改良DMEM/F12中,次日更换为普通含10%胎牛血清的高糖DMEM继续培养,并比较此改良方法与传统差速贴壁法的差异。结果:改良法获得的心肌细胞生长良好,接种24 h后几乎全部贴壁生长,细胞呈三角形、梭形或不规则形,个别细胞出现自主搏动,频率为10~30 beats/min不等。48 h后心肌细胞变长伸出伪足,部分细胞呈现同步搏动,频率接近50~80 beats/min。72 h后心肌细胞成菊花样交织成网,自发搏动趋于同步,频率加快至80~100 beats/min;96 h后细胞聚集成簇,呈岛屿样,同步搏动频率在100~120 beats/min左右,一周内细胞状态良好。改良法纯化原代心肌细胞的得率((1.17±0.15)×10^(6) vs(1.21±0.22)×10^(6),P>0.05)和存活率与传统差速贴壁法相当(93.3%±1.4%vs 92.2%±0.7%,P>0.05),但是改良方法获得的原代心肌细胞纯度更高(94.7%±2.1%vs 89.5%±1.3%,P<0.05),且用时较短((3.1±0.4)h vs(4.3±0.3)h,P<0.01)。结论:改良法获得心肌细胞耗时短、纯度高、结构功能保存完整,且实验重复和稳定性好,是一种理想且简单易行的的原代心肌细胞分离培养方法。

参附益心方对缺氧条件下大鼠原代心肌细胞线粒体DNA相关基因表达的影响

目的研究参附益心方(SF)对缺氧条件下大鼠原代心肌细胞线粒体DNA相关基因表达的影响。方法取1~3 d SD新生大鼠,分离、培养、鉴定原代心肌细胞。CCK-8检测SF、辅酶Q10(Coenzyme Q10)最适浓度。实验分为Normal(正常)组、Model(缺氧)组、SFL(参附益心方低剂量)组、SFH(参附益心方高剂量)组、Coenzyme Q10组,后三组在缺氧模型基础上分别给予SF 0.25 mg·ml-1、SF 0.5 mg·ml-1、Coenzyme Q101×10-4mol/L对细胞进行干预,收集细胞并用相关试剂盒检测ATP含量及乳酸脱氢酶(LDH)含量,RTPCR检测ND-1、ND-2、COX、tfam基因的表达。结果与Normal组相比,Model组心肌细胞ATP含量显著下降,LDH含量显著升高,ND-1、ND-2、COX、tfam基因表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与Model相比,SFL组LDH含量下降,ND-2、COX基因表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05);SFH组ATP含量升高,LDH含量下降,ND-1、ND-2、COX基因表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论参附益心方可上调原代心肌细胞线粒体DNA相关基因COX、ND1、ND2的表达,提高心肌ATP的含量,降低LDH含量,并呈剂量依赖性。

双黄连抗柯萨奇B_3型病毒感染大鼠原代心肌细胞的效应

目的 观察双黄连抗柯萨奇B3 病毒感染原代大鼠心肌细胞的作用 ,并初步探讨其机制。方法 选用出生 1～ 3天的Sprague Dawley大鼠 ,取其心室肌组织 ,制备原代大鼠心肌细胞 ,培养 72h后 ,用不同浓度的双黄连对抗10 0TCID50 柯萨奇B3 型病毒感染细胞 ,观察细胞病变 ,测定感染 36h后细胞上清液中的病毒滴度及肌酸磷酸激酶。结果 0 5、0 2 5、0 12 5 g/L双黄连均可明显减轻心肌细胞病变 ,降低细胞上清液的病毒滴度 ,减少感染心肌细胞肌酸磷酸激酶的释放 (分别和病毒对照组相比 ,P <0 0 1)。结论 双黄连对柯萨奇病毒感染的新生大鼠原代心肌细胞有保护作用。

高糖诱导的大鼠原代心肌细胞损伤对程序性坏死的影响及其机制

目的:探讨程序性坏死在高糖诱导的大鼠原代心肌细胞损伤中的变化及可能机制。方法:原代大鼠心肌细胞随机分为4组(n=9):正常对照组(Control,5.5mmol/L葡萄糖培养心肌细胞48h)、高糖组(HG,30mmol/L葡萄糖培养心肌细胞48h)、HG+Nec-1(30mmol/L葡萄糖+100μmol/L程序性坏死关键蛋白RIP1抑制剂Nec-1共同培养心肌细胞48h)组、高渗组(HPG,5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇共同培养心肌细胞48h)。MTT法检测各组心肌细胞活力,DHE荧光染色检测细胞氧化应激水平,ELISA法检测心肌细胞TNF-α、IL-6及IL-1β水平,Real-timePCR和Westernblot分别检测各组程序性坏死关键蛋白RIP1、RIP3、MLKLmRNA和蛋白水平的表达情况。结果:与Control组相比,HG组心肌细胞活力明显降低(P<0.01),氧化应激水平明显增高(P<0.01),TNF-α、IL-6及IL-1β水平升高明显(P<0.01),RIP1、RIP3、MLKLmRNA及蛋白水平表达均明显升高(P<0.05);与HG组相比,HG+Nec-1组心肌细胞活力明显升高(P<0.01),氧化应激水平明显下降(P<0.01),TNF-α、IL-6及IL-1β水平明显降低(P<0.01),RIP1、RIP3、MLKLmRNA及蛋白水平表达均下降(P<0.05)。结论:高糖诱导的原代大鼠心肌细胞损伤可引起程序性坏死的发生;抑制程序性坏死可减轻细胞损伤的机制,可能与抑制氧化应激、减轻炎症反应有关。

piR-16744对缺氧—复氧诱导的小鼠原代心肌细胞焦亡作用及机制研究

为探究piR-16744对H/R诱导的NMCs焦亡作用及机制,体外构建NMCs的H/R模型,设置缺氧6 h、12 h、24 h复氧6 h的时间梯度。使用RT-qPCR检测piR-16744的表达水平,WB检测焦亡相关蛋白GSDMD、GSDMD-C、Caspase-1及炎症因子IL-1β、IL-18的表达水平,LDH和PI染色检测细胞死亡率。结果显示,H/R 6/6 h时,NMCs中焦亡相关蛋白的表达水平最高。抑制NMCs中piR-16744的表达可促进焦亡相关蛋白表达,细胞死亡率升高;过表达piR-16744则抑制焦亡相关蛋白的表达,细胞死亡率降低;同时抑制piR-16744和Caspase-1的表达,焦亡相关蛋白的表达水平相较于单独抑制piR-16744组降低。研究表明piR-16744可通过依赖Caspase-1的经典焦亡信号通路调控NMCs焦亡。

原代心肌细胞培养

目的:探讨SD大鼠乳鼠心肌细胞的分离及培养方法,并进行形态学观察。方法:取出生1～3 d的SD大鼠的乳鼠,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分别消化心肌组织,差速贴壁法分离心肌细胞,并加入适量BrdU纯化心肌细胞,显微镜下观察心肌细胞形态及纯度。结果:成功分离培养心肌细胞并观察其形态,计算存活率92%,纯度90%,2～3 d出现同步搏动。结论:胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化可分离存活率较高的心肌细胞,用差速贴壁法并加入适量BrdU可纯化心肌细胞,使细胞搏动良好。

二甲双胍对H_2O_2刺激的原代心肌细胞活性的影响

目的:观察二甲双胍对H2O2刺激的原代培养心肌细胞活性的影响。方法:利用乳鼠心室肌组织培养出大鼠原代心肌细胞,分别用不同浓度(0、1、10、100、1000、3000、5000、10000μmol/L)的二甲双胍孵育0、15、30、60、120和180min,然后再与100μmol/LH2O2共孵育12h,MTT法检测细胞活性。结果:当二甲双胍作用浓度从0增加到100μmol/L,再增加到10000μmol/L时,H2O2刺激的心肌细胞活性先逐渐升高,后逐渐降低(F浓度=293.536,P<0.001);随二甲双胍作用时间的延长,H2O2刺激的心肌细胞活性逐渐升高(F时间=185.438,P<0.001)。进一步的观察结果显示,H2O2明显损伤原代心肌细胞的活性,100μmol/L二甲双胍作用60min可明显提高损伤细胞的活性(FH2O2=337.026,F二甲双胍=151.797,F交互=414.378,P均<0.001)。结论:低浓度二甲双胍对心肌细胞有明显的保护作用,可对抗活性氧对心肌细胞的损伤。

重组人生长停滞特异性蛋白6对缺氧/复氧原代心肌细胞及H9c2细胞损伤的影响

目的研究外源重组人生长停滞特异性蛋白6(rhGas6)对缺氧/复氧(H/R)诱导的原代乳鼠心肌细胞及H9c2细胞损伤的影响。方法体外培养新生Wistar大鼠心肌细胞及H9c2细胞,随机各分为3组:正常组、H/R组及rhGas6预处理组(rhGas6组)。观察各组细胞形态及心肌细胞搏动频率,检测细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)浓度及半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)活性变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果原代心肌细胞及H9c2细胞H/R组均较正常组细胞活力下降,凋亡率、LDH及Caspase-3水平均较正常组增高。而Gas6组与H/R组比较,细胞活力增加,凋亡率、LDH及Caspase-3水平均减低(P<0.05)。结论 rhGas6对H/R诱导的原代心肌细胞及H9c2细胞损伤均发挥着潜在的保护作用,并可能是通过抑制Caspase-3活性减少细胞凋亡发挥的。

盐霉素对鸡原代心肌细胞的毒性作用及其机制的初步研究

初步探讨盐霉素对鸡原代心肌细胞的毒性作用及其毒性机制。采用差速贴壁法结合化学纯化法分离鸡原代心肌细胞,应用免疫荧光法鉴定心肌细胞纯度,给予1、5、10、20、50μg·mL-1盐霉素处理后,观察心肌细胞形态,采用MTT法测定盐霉素对心肌细胞活性的影响;比色法检测心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放、肌酸激酶(CK)活性;流式细胞术分析盐霉素对心肌细胞凋亡及线粒体膜电位的影响;电子显微镜观察盐霉素对心肌细胞超微结构的影响;荧光显微镜观察盐霉素对心肌细胞氧化应激的影响;比色法测定盐霉素对心肌细胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白酶活性的影响;qRT-PCR检测Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、细胞色素C(Cyt-C)、Bax及Bcl-2mRNA的转录水平。结果表明:分离所得鸡原代心肌细胞形态良好,纯度大于90%;盐霉素以显著的浓度-时间依赖性方式抑制心肌细胞生长并诱导细胞死亡;盐霉素导致心肌细胞LDH释放极显著增加(P<0.01),细胞内CK酶活性增强,呈浓度依赖性(P<0.01);盐霉素导致心肌细胞凋亡率极显著升高(P<0.01),线粒体膜电位(ΔΨm)明显下降(P<0.01);电子显微镜观察显示盐霉素导致心肌细胞线粒体严重肿胀、空泡化,嵴溶解甚至消失;盐霉素导致心肌细胞内活性氧(ROS)显著升高;细胞质Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白酶活性均极显著升高(P<0.01);qRT-PCR结果表明凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Cyt-C及Bax mRNA转录上调,Bcl-2mRNA转录下调(P<0.01)。盐霉素可以通过细胞凋亡引起鸡心肌细胞死亡,线粒体途径和死亡受体途径可能共同参与了盐霉素诱导的鸡心肌细胞凋亡。

低氧工作站建立大鼠原代心肌细胞缺氧模型

心肌梗死、缺血再灌注损伤等多种心血管疾病的发生和发展过程中多伴有细胞缺氧,进而引起细胞损伤,影响心正常生理功能.体外心肌细胞缺氧模型能够较好排除神经、体液等因素及个体差异性的影响,更加有利于对缺氧性心肌损伤发生机制的研究,为探讨如何保护缺氧心肌提供重要理论基础.因此,建立体外细胞缺氧模型是从细胞和分子水平研究该类疾病的重要方法,在多种缺血缺氧性疾病中均得到广泛应用.目前,国内外应用较多的心肌细胞缺氧模型包括物理法缺氧模型和化学法缺氧模型.如何更好地模拟体内真实缺氧环境,建立更加稳定、理想的缺氧模型,一直是该领域研究的关键环节之一.

用大鼠原代心肌细胞构建工程化心肌组织的研究

目的探索用大鼠原代心肌细胞构建工程化心肌组织的方法。方法用胶原、M atrigel、2倍DMEM分别与含0.04%EDTA的0.25%胰酶制备的乳鼠原代心肌细胞(实验组)和0.1%胰酶制备的原代心肌细胞(对照组)混合,注入环形槽内形成心肌条带,一周后行力学拉伸继续培养一周。常规HE染色等对组织工程化心肌组织,即心肌条带进行评价。结果心肌条带出现自发性跳动,HE染色显示与正常成年大鼠心肌组织类似,电镜结果显示条带中的心肌细胞含有丰富的肌原纤维,肌小节结构和Z带清晰可见。用含0.04%EDTA的0.25%胰酶制备的原代乳鼠心肌细胞构建的心肌条带,拉伸后第4天形成一致性跳动。免疫组化检测提示肌钙蛋白阳性细胞数多于对照组。电镜观察显示,条带的心肌细胞中肌原纤维较对照组明显增多。结论这一方法可构建工程化心肌组织,心肌细胞制备方法的改进以及液态Ⅰ型胶原浓度的精确测定,可显著提高构建心肌条带的成功率及条带的生理功能,使其更接近正常心肌组织。

抗心律失常肽10对柯萨奇B3病毒感染小鼠原代心肌细胞缝隙连接蛋白43的影响

目的：建立原代心肌细胞柯萨奇B3病毒（CVB3）感染性病毒性心肌炎的模型，使用抗心律失常肽10（AAP10）对该疾病模型进行干预，观察其对小鼠原代心肌细胞及缝隙连接蛋白43（Cx43）的影响。方法：选取出生1-3天的BALB/C小鼠10只进行原代心肌细胞培养，分别用不同剂量的抗心律失常肽10的培养液进行干预100倍组织细胞培养半数感染量（TCID50）CVB3感染的心肌细胞，将原代小鼠心肌细胞分为细胞对照组、病毒对照组、低剂量干预组、高剂量干预组4组，每组8孔，通过蛋白免疫印迹法测定细胞缝隙连接蛋白43的表达水平。结果：缝隙连接蛋白43相对表达水平低剂量干预组[（71.46±2.69）%]和高剂量干预组[（83.56±3.74）%]明显高于病毒对照组[（44.92±4.49）％]，随着干预剂量增加，其缝隙连接蛋白43相对表达水平进一步显著增加，差异均有统计学意义（P均〈0.001）。结论：抗心律失常肽10可保护心肌细胞，增加缝隙连接蛋白43的表达，减少病毒性心肌炎的心肌损害。