RNAi沉默原代星形胶质细胞IL-17基因表达方法的建立

目的通过基因沉默技术构建质粒成功转染原代星形胶质细胞(Ast)抑制IL-17表达,探讨IL-17的功能。方法在制备原代Ast基础上,应用IL-17基因沉默质粒pGenesil-1A和B,用Lipofectamine 2000转染Ast,通过荧光分析法、RT-PCR法、Western Blotting法观察IL-17基因沉默后效果。结果携带pGenesil-1B和A的IL-17基因沉默质粒制备成功后,免疫荧光携带pGenesil-1B转染效果明显高于pGenesil-1A,其转染率可高达56.72%;基因沉默组在转染后72 h内任一时间点IL-17 mRNA表达均低于正常对照组和基因沉默对照组(P<0.05),且24 h IL-17表达最低(P<0.05)。蛋白表达上,在IL-17基因沉默后3、5、7 d,其蛋白表达仍持续减低(P<0.05)。结论应用Lipofectamine 2000可成功将IL-17 RNAi pGenesil-1质粒转染至原代星形胶质细胞。

抑制PI3K/AKT/GSK-3β信号通路对冈田酸诱导原代星形胶质细胞衰老情况的影响

目的研究冈田酸(OA)诱导的原代星形胶质细胞中通过抑制磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/糖原合成激酶(GSK)-3β信号通路对p21、p53衰老蛋白表达水平和衰老阳性细胞表达的影响,探讨OA诱导星形胶质细胞衰老情况及相关机制。方法免疫荧光鉴定原代星形胶质细胞,CCK8法筛选OA药物浓度,然后用LY294002、OA分别处理或联合处理细胞,Western印迹测定细胞中p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、p21、p53蛋白表达水平的变化及β-半乳糖苷酶染色检测衰老阳性细胞。结果免疫荧光鉴定原代星形胶质细胞结果显示其纯度达到95%以上,CCK8法筛选出OA药物处理浓度为30 nmol/L,OA组中p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、p21、p53蛋白表达较正常对照组显著升高(P<0.05),衰老阳性细胞数明显增加,但LY294002+OA组p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β、p21、p53蛋白表达水平较OA组明显降低,并且衰老阳性细胞数也明显减少(P<0.05)。结论通过OA处理能使星形胶质细胞发生衰老,LY294002处理能通过抑制PI3K/AKT/GSK-3β信号通路缓解细胞的衰老情况,提示高磷酸化Tau诱导星形胶质细胞衰老可能与PI3K/AKT/G3K-3β信号通路密切相关。

HCMV感染对人原代星形胶质细胞IL-6和IL-8表达的影响

目的观察人巨细胞病毒(HCMV)感染时人原代星形胶质细胞分泌的IL-6和IL-8的表达变化。方法分离纯化人原代星形胶质细胞并用免疫荧光法鉴定纯度。用HCMV感染原代星形胶质细胞制作HCMV感染模型,采用RT-PCR及免疫荧光法检测感染后星形胶质细胞中的即刻早期(IE)mRNA和蛋白的表达(进行模型鉴定)。RT-PCR及Western blot法检测正常培养和感染HCMV的人原代星形胶质细胞中IL-6和IL-8 mRNA和蛋白的表达。结果 HCMV能够感染人原代星形胶质细胞。正常培养的人原代星形胶质细胞能够表达IL-6 mRNA和蛋白,但不表达IL-8;HCMV感染初期的人原代星形胶质细胞中IL-6 mRNA和蛋白均表达增加,IL-8表达被激活(P均<0.05),而感染后期两种因子的表达明显下调。结论 HCMV感染能够诱导人原代星形胶质细胞IL-6和IL-8的表达异常。

莱菔硫烷对Nrf2原代星形胶质细胞Ⅱ相酶的诱导作用

目的 探索莱菔硫烷(SFN)对培养的Nrf2+/+、Nrf2-/-原代星形胶质细胞Ⅱ相酶的诱导作用。方法 取经基因鉴定的Nrf2+/+、Nrf2-/-新生乳鼠,取出大脑皮质分离培养原代星形胶质细胞,并进行纯化与鉴定。将细胞分为Nrf2+/+和Nrf2-/-组,每组又分为溶剂对照组和SFN药物干预组。通过给予不同浓度的SFN干预Nrf2+/+组细胞,测定Ⅱ相酶的表达来选择最佳给药浓度。然后分别给予Nrf2+/+、Nrf2-/-组DMSO和最适浓度的SFN,通过Western blot测定Ⅱ相酶的表达。结果 不同浓度SFN干预Nrf2+/+星形胶质细胞显示,10μmol·L^(-1)对Ⅱ相酶Gclm、Nqo1、Ho1蛋白表达的诱导作用最强,为最佳给药浓度。Nrf2+/+和Nrf2-/-细胞分别给予10μmol·L^(-1) SFN处理后,Ho1均能明显上调。Nqo1和Gc1m只在Nrf2+/+细胞中明显上调,在Nrf2-/-细胞中不上调。而对于Gss和Gclc,给药后Nrf2+/+和Nrf2-/-细胞两种酶表达均无明显变化。结论 SFN对原代培养的星形胶质细胞Ho1的诱导不完全依赖于核转录因子Nrf2;对Nqo1、Gclm的诱导很大程度上依赖于转录因子Nrf2;对Gss和Gclc的表达无明显诱导作用。

银杏二萜内酯K对D-半乳糖诱导的小鼠原代星形胶质细胞抗衰老作用

目的研究银杏二萜内酯K(ginkgolide K,GK)对D-半乳糖诱导的小鼠原代星形胶质细胞抗衰老作用及可能机制。方法以小鼠原代星形胶质细胞为研究对象,建立D-半乳糖诱导的衰老模型,设置对照组、模型组和GK组,GK(50μg/mL)预处理3 h后,以150 mmol/L D-半乳糖造模6 d,采用β-半乳糖苷酶染色法检测衰老星形胶质细胞;Western blotting法测定衰老标志蛋白(p21、p53和Lamin B1)、沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor),BDNF、自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ/I(microtubule associated protein 1light chain 3-Ⅱ/I,LC3-Ⅱ/I)和自噬选择性底物p62表达;ELISA检测衰老相关分泌表型[白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)];免疫荧光检测增殖标志分子Ki67表达。结果与对照组比较,D-半乳糖显著诱导原代星形胶质细胞β-半乳糖苷酶阳性表达(P<0.001),促进衰老标志蛋白p21、p53的上调和Lamin B1的下调(P<0.05、0.01),减少增殖标志分子Ki67的表达(P<0.01),表明成功构建了公认的细胞衰老模型。与模型组比较,GK显著减少β-半乳糖苷酶阳性表达(P<0.001),下调p21、p53和上调Lamin B1蛋白的表达(P<0.05、0.01),增加Ki67的表达(P<0.01),表明GK具有抗衰老作用。此外,GK显著促进BDNF蛋白表达(P<0.05),减少TNF-α的分泌(P<0.05),上调SIRT1和自噬标志蛋白LC3-Ⅱ/I表达(P<0.05、0.01),减少p62蛋白表达(P<0.01)。结论GK可有效抑制原代星形胶质细胞的衰老,其作用机制可能与上调SIRT1、BDNF表达和促进细胞自噬有关,从而多维度协同达到抗细胞衰老的效应。

毛蕊花苷对血红素氧化酶-1过表达大鼠原代星形胶质细胞铁沉积的影响

目的观察毛蕊花苷(verbascoside)对过表达血红素氧化酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)的大鼠原代星形胶质细胞铁离子沉积的影响,寻找抗阿尔兹海默病的新药物。方法体外培养和纯化大鼠原代星形胶质细胞,构建转染HO-1基因的星形胶质细胞模型,用CCK-8法检测细胞损伤,Western blotting法检测HO-1蛋白的表达,普鲁士蓝染色法检测细胞铁离子沉积。结果 95%以上的细胞呈胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性,表明成功培养出星形胶质细胞;毛蕊花苷对HO-1基因转染后的原代星形胶质细胞具有不同程度的增殖抑制效应,抑制率与药物浓度呈正相关;转染HO-1基因入星形胶质细胞后,HO-1蛋白表达增加6.86倍;在施加毛蕊花苷干预后,20、40、60μmol·L^(-1)均能不同程度地降低HO-1蛋白的表达,同时不同程度地减少由过表达HO-1导致的铁离子沉积(20μmol·L^(-1)降低47.69%,40μmol·L^(-1)降低51.63%)。结论毛蕊花苷可以抑制过表达HO-1大鼠原代星形胶质细胞的铁离子沉积,可能成为针对"铁-氧化损伤"途径的抗阿尔兹海默病的新药物。

PAS-Na对锰致大鼠基底核原代星形胶质细胞损伤的拮抗模型探讨

目的探讨对氨基水杨酸钠(PAS-Na)对锰(Mn)致大鼠基底核原代星形胶质细胞损伤的拮抗作用,为深入Mn中毒机制及其防治研究提供科学技术平台。方法取SPF级新生24 h内SD大鼠基底核进行消化、传代培养,用荧光免疫法鉴定星形胶质细胞。给予不同浓度Mn(125、250、500和1000μmol/L)和PAS-Na(5、50、500和5000μmol/L)对星形胶质细胞处理24 h,用MTT法测定细胞存活率,按细胞存活率75%为Mn细胞毒性的筛选标准,细胞存活率100%为PAS-Na无细胞毒性标准,选择染Mn和PAS-Na干预剂量。结果染不同浓度Mn 24 h后,星形胶质细胞出现不同程度的肿胀或皱缩,并随染锰浓度增加而加重。正常培养液(对照)、125、250、500和1000μmol/L Mn组细胞存活率依序为100.0%、91.5%、83.3%、78.2%和55.6%。与对照组比较,250、500和1000μmol/L Mn组细胞存活率均降低(P<0.05)。随着Mn浓度增高,细胞存活率呈剂量-反应性下降(r=0.979)。给予5、50、500和5000μmol/L PAS-Na处理24 h后,细胞形态和存活率无明显改变。故选择500μmol/L Mn作为染Mn剂量,50、150和450μmol/L PAS作为干预剂量。与500μmol/L染Mn组比较,150和450μmol/L PAS-Na干预后,细胞皱缩程度减轻,细胞突起增多。150和450μmol/L PAS-Na干预组细胞存活率(89.7%、93.2%)比染Mn组(75.6%)高(P<0.05)。结论染500μmol/L Mn24 h后,星形胶质细胞出现明显的毒性,PAS-Na对染Mn细胞毒性有明显的干预作用,提示PAS-Na对染Mn大鼠原代星形胶质细胞损伤的拮抗作用模型构建成功。

P2X_7受体在原代培养星形胶质细胞生长中的作用

目的探讨ATP是否促进原代培养的星形胶质细胞(astrocytes,As)发生类似反应性星形胶质化的变化以及嘌呤类受体P2X7在该过程中的作用。方法原代As的分离和培养;实时照相观察As形态变化;用Br-dU掺入法及流式细胞观察As增殖变化;用荧光标记实时定量PCR(real-time RT-PCR)检测GFAP mRNA,P2X7mRNA,TGF-β1mRNA表达的变化;用Western blot检测GFAP表达;ELISA检测培养上清中TGF-β1的变化。结果成功分离并培养原代As,免疫荧光鉴定阳性率为99%。不同浓度ATP(50μmol/L,100μmol/L,500μmol/L)作用于As,均可使之表现出类似反应性胶质化的形态改变,表现为胞浆丰富,细胞突起增加且更为明显。ATP100μmol/L作用1d后,As的S期细胞数目明显增加,提示细胞增殖的活跃,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine,5-BrdU)掺入法显示细胞核阳性率明显增加。500μmol/L浓度的ATP能促进As的GFAP mRNA,P2X7mRNA表达。用P2X7特异性的受体激动剂2′-3-′O-(4-benzoylbenzoyl)-adenosine-5′-triphosphate(BzATP)50μmol/L,75μmol/L,100μmol/L作用于原代培养的As,在培养基有Ca2+情况下可明显促进GFAP表达。在培养基有Ca2+的情况下BzATP作用2h及12h时As中TGF-β1mRNA升高。培养上清中TGF-β1蛋白的含量在8h及48h均有升高。TGF-β1中和抗体能部分抑制P2X7引起的As GFAP含量的增加。结论100μmol/L的ATP可以促进As增殖。各种浓度ATP均可促进As形态产生类似胶质化反应的变化。P2X7特异性受体激动剂BzATP可引发胶质化样反应,并且在有Ca2+的情况下促进TGF-β1的转录和释放。TGF-β1参与了P2X7受体诱导的类似反应性星形胶质化过程。

帕瑞昔布对过氧化氢诱导的原代星形胶质细胞氧化应激的保护作用（英文）

目的:评估帕瑞昔布对过氧化氢诱导的大鼠原代星形胶质细胞氧化应激状态的保护作用,并初步探讨其作用机制。创新点:首次在大鼠原代星形胶质细胞中证实帕瑞昔布对过氧化氢诱导的氧化应激具有保护作用,且此作用可能与Bax、Bcl-2和BDNF的失调有关。方法:设立如下四组对照:(1)阴性对照组;(2)100μmol/L H_2O_2处理组(处理时间为24 h);(3)80μmol/L帕瑞昔布处理组;(4)160μmol/L帕瑞昔布处理组(第三和第四组先用帕瑞昔布处理24 h,再用100μmol/L H_2O_2处理24 h)。用荧光显微镜观察星形胶质细胞的形态,用MTT法检测星形胶质细胞的存活率,用荧光探针二氯荧光黄双乙酸盐(DCDHF-DA)检测星形胶质细胞内氧自由基的含量,并用碘化丙啶(PI)染色检测细胞的凋亡状态。最后用反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测Bax、Bcl-2和BDNF三种蛋白在4组中的表达水平。结论:H_2O_2处理可以导致星形胶质细胞的形态发生改变(图1)和存活率降低(图2),提高星形胶质细胞内的氧自由基水平(图3),同时诱导细胞凋亡(图4)。然而,所有这些变化都可以被帕瑞昔布逆转。此外,我们发现,Bax、Bcl-2和BDNF的表达水平在H_2O_2处理时失调,而在帕瑞昔布预处理时恢复正常。综上所述,帕瑞昔布对H_2O_2诱导的氧化应激具有保护作用。

Foxp1基因编码区序列的克隆及其在星形胶质细胞中的表达

目的体外分离培养原代星形胶质细胞,在星形胶质细胞中克隆Foxp1基因编码区序列(CDS)区并过表达。方法利用机械分离法获取小鼠原代星形胶质细胞;异硫氰酸胍法(TRIzol法)提取原代星形胶质细胞内总RNA并逆转录为cDNA,克隆CDS区、测序;利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)和SnapGene软件对测序结果与NCBI库内小鼠中4个Foxp1转录本的CDS区进行对比;将星形胶质细胞中Foxp1基因的CDS克隆到表达载体上,并转染到HEK293T细胞内验证其表达。结果体外成功分离培养原代星形胶质细胞,且纯度达95%及以上;克隆出星形胶质细胞内Foxp1的CDS,相较参考序列Foxp1转录本4的CDS,其在514/515处插入3个连续碱基AGC;将克隆有Foxp1基因CDS区的表达载体转入HEK293T细胞内后可见在约106 kD处有Foxp1蛋白表达。结论成功分离培养原代星形胶质细胞并获取Foxp1新的CDS。

尼古丁通过PI3K/AKT信号通路上调星形胶质细胞HSF1的表达

目的:研究尼古丁对星形胶质细胞热休克转录因子1(HSF1)的表达的影响,并探讨其机制。方法:分离新出生24 h内乳鼠大脑皮质,进行原代培养并鉴定为星形胶质细胞,待细胞成熟后分为正常对照组、尼古丁处理组,PI3K/AKT信号通路阻断剂LY294002处理组和尼古丁+LY294002处理组,正常对照组不做任何处理;尼古丁处理组用5μmol/L尼古丁分别处理星形胶质细胞6、12、18、24 h; LY294002处理组只加10μmol/L LY294002处理;尼古丁+LY294002处理组是先加10μmol/L LY294002处理2 h后,再加入5μmol/L尼古丁共同处理18 h,免疫印迹法观察各组HSF1蛋白的表达。结果:与正常对照组相比,尼古丁处理组星形胶质细胞内HSF 1蛋白的表达上调(P <0. 05);与尼古丁处理组比较,LY294002+尼古丁处理组星形胶质细胞内HSF1表达明显受到抑制(P <0. 05)。结论:尼古丁通过PI3K/AKT信号通路上调星形胶质细胞HSF1蛋白表达。

PNU通过PI3K/AKT信号通路上调星形胶质细胞HSP70的表达

目的:研究PNU对星形胶质细胞热休克蛋白70(HSF70)表达的影响,并探讨其机制。方法:分离新出生24 h内乳鼠大脑星形胶质细胞原代培养并鉴定,传1～3代待细胞成熟后分为正常对照组、PNU处理组,PI3K/AKT信号通路阻断剂(LY294002)处理组和PNU+LY294002处理组,正常对照组不做任何处理,PNU处理组用5μmol/L PNU分别处理6、12、18、24 h,LY294002处理组只加10μmol/L LY294002处理,PNU+LY294002处理组是先加10μmol/L LY294002处理2 h后、再加入5μmol/L PNU共同处理18 h,免疫印迹法观察各组星形胶质细胞内HSF70蛋白的表达。结果:与正常对照组相比,PNU处理组星形胶质细胞内HSP70蛋白的表达上调(P <0. 05);与PNU处理组比较,LY294002+PNU处理组星形胶质细胞内HSP70表达明显受到抑制(P <0. 01)。结论:PNU通过PI3K/AKT信号通路调控星形胶质细胞HSP70蛋白表达。

脂多糖促进的小鼠原代星形神经胶质细胞中TGF-α的释放不依赖于ADAM17的剪切作用

转化生长因子-α(TGF-α)是调控细胞生长的一种肽类生长因子.其前体pro-TGF-α是一类跨膜蛋白,在一些金属蛋白酶(如去整合素金属蛋白酶17,ADAM17)的切割作用下细胞外50个氨基酸左右的可溶性片段被释放,为成熟的TGF-α.TGF-α与其受体EGFR结合,激活EGFR下游信号通路,该通路对星形胶质细胞的生长和增殖有重大的影响.一定剂量的脂多糖(LPS)能够促进星形胶质细胞的增殖和活化,但脂多糖激活星形胶质细胞的途径并不清楚.实验发现,在原代星形胶质细胞中,1μg/mL的LPS作用1h,就能显著提高TGF-α的释放.相反,1μg/mL的LPS不影响人胶质瘤细胞系U251和中国仓鼠肺细胞CHL中TGF-α的释放,表明原代细胞对LPS的刺激作用更为敏感.金属蛋白酶抑制剂GM6001对LPS诱导的原代星形胶质细胞TGF-α释放增加作用无显著抑制,表明这种促进释放作用是不依赖于ADAM17的.在原代星形胶质细胞中,1μg/mL的LPS作用48h对ADAM17的mRNA表达无影响;而在U251细胞中,1μg/mL的LPS作用48h能够显著提高ADAM17蛋白的表达.不同于胶质瘤细胞,LPS对于原代星形胶质细胞的活化可能是通过直接促进TGF-α的释放来完成,且此释放不依赖于ADAM17.

探讨脂多糖诱导的中枢神经系统炎症反应对体外血脑屏障功能的影响

目的利用bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞及星形胶质细胞建立体外血脑屏障模型,并观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的中枢炎症对血脑屏障功能的影响。方法培养小鼠原代脑微血管星形胶质细胞,利用流式细胞术对原代星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白进行细胞纯度鉴定后,将其与bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞进行共培养构建体外血脑屏障模型。将小鼠原代星形胶质细胞、bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞、共培养的血脑屏障模型均分为对照组和LPS处理组。LPS处理浓度为20μg/ml,处理时间为24 h。通过跨内皮细胞电阻(trans-epithelium electrical resistant,TEER)检测血脑屏障功能,Western blot检测血脑屏障连接蛋白Occludin和ZO-1蛋白含量。结果原代培养的星形胶质细胞呈典型的多突起形态,流式细胞学鉴定细胞纯度为96%。三种细胞分别进行LPS处理后,TEER值均较各自对照组明显下降(P<0.05),Occludin和ZO-1蛋白相对表达量均较各自对照组明显下降(P<0.05)。结论bEND.3小鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞共培养可成功建立一种体外血脑屏障模型,LPS诱导的中枢神经系统炎症反应会使血脑屏障完整性受损,破坏其功能。

Effect of lead on ERK activity and the protective function of bFGF in rat primary culture astroglia

客观：为了在 phosphorylatedextracellular 的层次上观察铅的效果，在 lead-inducedeffects 上在老鼠 astroglialcells 的主要文化和基本成纤维细胞生长因素(bFGF ) 的可能的保护的效果的细胞质表明调整的激(津贴) 。方法：从 1 ～ 6 d 的主要 astroglia 房间旧 Wistar 老鼠是有教养的。有 MEKl 的 cellspretreated (激活 mitogen 的蛋白质激激 1 ) 分别地，禁止者 PD98059 和 bFGF 在不同时间暴露于不同集中的 Pb 醋酸盐。Westernblotting 和反向的抄写聚合酶连锁反应(RT-PCR ) 方法被用来检测蛋白质和英皇家空军之阶级最低之兵的 mRNA 表情。结果：为英皇家空军之阶级最低之兵的 mRNA 表示达到顶点在铅暴露的开始以后的 15 min ( P 【 0.05 )并且津贴的蛋白质表示在 30 min 达到顶点( P 【 0.05 ) .ERK mRNA 层次和津贴蛋白质层次在铅暴露的 60 和 120 min 以后回到了基线，分别地( P 】 0.05 )。在对待铅的房间的津贴层次的增加能是禁止的 byPD098059。在由铅的房间的英皇家空军之阶级最低之兵的激活被预告的处理与 bFGF 阻止。全部的 ERKprotein 层次没在一样的试验性的条件下面变化(P 】 0.05 ) 。结论: 低级的铅暴露通过 MEK 小径导致了英皇家空军之阶级最低之兵的短暂激活，它然后在铅的继续的存在回到了基础层次。外长的 bFGF 保护了从毒害的铅在 astroglia 表明部件的英皇家空军之阶级最低之兵。