原代猪肝细胞PERV检测及其意义

目的:探讨猪肝细胞内源性逆转录病毒(PERV)检测方法及意义. 方法:采用体外二步灌流法获取猪肝细胞,使用特异性引物对其前病毒序列进行观察;以未逆转录PCR为对照,采用RT-PCR方法检测原代猪肝细胞PERV携带及释放情况,并用套式RT-PCR对扩增产物进行鉴定. 结果:原代猪肝细胞基因组中可检测到PERV前病毒序列,肝细胞中亦可检测到特异性的PERV RNA序列.在缺乏有丝分裂原刺激的情况下,猪肝细胞普通培养的不同时段均可检测到病毒释放,并可持续至细胞死亡. 结论:中国实验小型猪肝细胞携带PERV病毒序列,猪肝细胞普通培养时可释放该病毒,其感染性及生物安全性尚需进一步研究.

原代猪肝细胞培养体系及培养模式的初步探讨

目的 探索一高密度、高效率的原代猪肝细胞培养方法 ,为生物人工肝的生物材料提供一种有效的培养模式。方法 采用改良Seglen二步胶原酶灌注法分离肝细胞 ,分别将 5× 10 6 的肝细胞加入胎牛血清、猪门静脉血清的培养体系中进行方瓶静止培养及聚球培养。结果 肝细胞在接种后呈明显的Cytodex 3聚集趋势。门静脉血清培养体系中肝细胞的Albumin、Urea合成能力明显高于胎牛血清组。在培养后的前 3周门静脉血清培养体系中聚球细胞模式优于微载体静止培养模式。结论 与胎牛血清培养体系相比 ,猪门静脉血清培养体系更适合原代猪肝细胞高密度培养。聚球培养是一种较为理想的原代猪肝细胞培养模式。

原代小型猪肝细胞的分离培养及其功能

目的:研究原代小型猪肝细胞的分离、培养及肝细胞的形态学变化及其功能特性.方法:用体外灌流装置,DTA和胶原酶两步灌流法消化分离小型猪肝细胞.在含100 ml/L小牛血清及其附助因子的RPMI 1640培养基中培养.对不同培养时间的肝细胞进行形态学观察.同时测定不同培养时期肝细胞生化合成及生物转化功能.结果:(1)肝细胞产量为6.0×109～8.2×109(7.0 × 109±0.79×109)/每只猪肝;(2)肝细胞活率为90.0～99%(94.4±3.07%);(3)肝细胞具有正常肝细胞的超微结构特征;(4)接种培养后肝细胞增生生长旺盛;(5)接种后20 h内每107个肝细胞尿素及白蛋白的合成量分别为1.21～1.50 mmol/L及0.58～0.80 g/L;(6)肝细胞数在1.25×107个～1.60×107个时,利多卡因的转化率在24 h时均在80%以上,随着时间的延长及肝细胞数的增多,利多卡因的转化率逐渐增加.结论:本方法分离获取的肝细胞产率高、活性高、增生生长旺盛、具有良好的生物合成及生物转化功能,可作为生物人工肝较为理想的细胞来源.