原代猪肝细胞PERV检测及其意义

目的:探讨猪肝细胞内源性逆转录病毒(PERV)检测方法及意义. 方法:采用体外二步灌流法获取猪肝细胞,使用特异性引物对其前病毒序列进行观察;以未逆转录PCR为对照,采用RT-PCR方法检测原代猪肝细胞PERV携带及释放情况,并用套式RT-PCR对扩增产物进行鉴定. 结果:原代猪肝细胞基因组中可检测到PERV前病毒序列,肝细胞中亦可检测到特异性的PERV RNA序列.在缺乏有丝分裂原刺激的情况下,猪肝细胞普通培养的不同时段均可检测到病毒释放,并可持续至细胞死亡. 结论:中国实验小型猪肝细胞携带PERV病毒序列,猪肝细胞普通培养时可释放该病毒,其感染性及生物安全性尚需进一步研究.

原代小型猪肝细胞的分离培养及其功能

目的:研究原代小型猪肝细胞的分离、培养及肝细胞的形态学变化及其功能特性.方法:用体外灌流装置,DTA和胶原酶两步灌流法消化分离小型猪肝细胞.在含100 ml/L小牛血清及其附助因子的RPMI 1640培养基中培养.对不同培养时间的肝细胞进行形态学观察.同时测定不同培养时期肝细胞生化合成及生物转化功能.结果:(1)肝细胞产量为6.0×109～8.2×109(7.0 × 109±0.79×109)/每只猪肝;(2)肝细胞活率为90.0～99%(94.4±3.07%);(3)肝细胞具有正常肝细胞的超微结构特征;(4)接种培养后肝细胞增生生长旺盛;(5)接种后20 h内每107个肝细胞尿素及白蛋白的合成量分别为1.21～1.50 mmol/L及0.58～0.80 g/L;(6)肝细胞数在1.25×107个～1.60×107个时,利多卡因的转化率在24 h时均在80%以上,随着时间的延长及肝细胞数的增多,利多卡因的转化率逐渐增加.结论:本方法分离获取的肝细胞产率高、活性高、增生生长旺盛、具有良好的生物合成及生物转化功能,可作为生物人工肝较为理想的细胞来源.

猪肝细胞的分离与原代培养

本文利用原位两步灌流法分离猪肝细胞,进行平面培养,并动态观察细胞生长过程中的形态,建立了稳定的猪肝细胞的分离与原代培养体系,满足了生物人工肝体外支持系统对肝细胞的需求。

经肝静脉与门静脉离体灌注分离猪肝细胞的比较研究

目的 比较经门静脉顺行灌注法与肝静脉逆行灌注法离体分离屠宰场猪肝细胞并观察原代培养的肝细胞形态学变化。方法 经门静脉顺行和肝静脉逆行离体胶原酶灌注法分离猪肝细胞 ,并在含 10 %小牛血清的WilliamsE培养基中培养。结果 顺行灌注与逆行灌注法分离猪肝细胞的平均产量分别为 (8.8± 0 .5 )× 10 9 肝与 (1.5± 0 .1)× 10 1 0 肝 (P <0 .0 5 ) ,平均肝细胞活性为 (88.7± 1.5 ) %与 (90 .3± 1.5 ) % (P >0 .0 5 )。分离后的肝细胞增生活跃 ,生长良好 ,未见污染。结论 采用肝静脉逆行灌注法可以分离获得高产率、高活性肝细胞 。

原代猪肝细胞培养体系及培养模式的初步探讨

目的 探索一高密度、高效率的原代猪肝细胞培养方法 ,为生物人工肝的生物材料提供一种有效的培养模式。方法 采用改良Seglen二步胶原酶灌注法分离肝细胞 ,分别将 5× 10 6 的肝细胞加入胎牛血清、猪门静脉血清的培养体系中进行方瓶静止培养及聚球培养。结果 肝细胞在接种后呈明显的Cytodex 3聚集趋势。门静脉血清培养体系中肝细胞的Albumin、Urea合成能力明显高于胎牛血清组。在培养后的前 3周门静脉血清培养体系中聚球细胞模式优于微载体静止培养模式。结论 与胎牛血清培养体系相比 ,猪门静脉血清培养体系更适合原代猪肝细胞高密度培养。聚球培养是一种较为理想的原代猪肝细胞培养模式。