肿瘤坏死因子-α联合转化生长因子-β1作用于原代白血病细胞对Gli2表达的影响

目的：证明肿瘤坏死因子-α（TNF-α）可以促进转化生长因子-β（TGF-β）降低原代白血病细胞Gli2的表达。方法 ：（1）Western blot检测白血病细胞Gli2蛋白的表达。（2）不同浓度TGF-β1和TNF-α分别作用于原代白血病细胞后,检测Gli2基因或蛋白以及TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ蛋白的表达。（3）TGF-β1、TNF-α及SIS3作用于原代白血病细胞24 h后,检测Gli2蛋白的表达。结果：（1）3株原代白血病细胞均有Gli2蛋白的表达。（2）1~10 ng/m L TGF-β1作用于原代白血病细胞12~24 h,与对照组相比Gli2基因m RNA表达降低明显;5 ng/m L TNF-α则没有显著变化。（3）5 ng/m L TNF-α作用于原代白血病细胞24 h后,与对照组相比TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ蛋白表达均有增高。（4）单独应用TGF-β以及联合应用TNF-α和TGF-β作用24 h后,与对照组相比Gli2基因的表达均降低明显,而且TNF-α＋TGF-β组Gli2基因的表达较TGF-β组降低更明显。结论：联合应用TNF-α和TGF-β比单独应用TGF-β能进一步减少原代白血病细胞Gli2基因的表达。

萝卜硫素增加HL-60和人原代白血病细胞对化疗药敏感性实验研究

目的:探讨萝卜硫素(SF)对白血病细胞化疗药物敏感性的作用。方法:琼脂半固体集落培养法和MTT法检测不同浓度的萝卜硫素对HL-60细胞增殖的影响及协同化疗药对细胞生长的抑制作用;PHA-LCM液相-半固体二步培养SF协同化疗药抑制人原代白血病细胞生长。结果:琼脂半固体集落培养法和MTT法证实在一定浓度范围内SF对HL-60细胞增殖抑制(P<0.05,P<0.01),呈剂量依赖性,SF能够增强HL-60细胞对化疗药物高三尖杉酯碱(Hom)和阿糖胞苷(Ara-c)敏感性(P<0.05);PHA-LCM液相-半固体二步培养法证实SF在一定浓度范围内对人原代白血病细胞有抑制作用(P<0.05,P<0.01),呈剂量依赖性,并增加人原代白血病细胞对化疗药Hom和Ara-c敏感性。结论:萝卜硫素在一定浓度下有效抑制白血病细胞增殖,并能增强化疗药物的敏感性。

人端粒酶核糖核酸反义寡核苷酸可增强顺铂诱导原代白血病细胞凋亡的作用

目的探讨人端粒酶核糖核酸(humantelomeraseribonucleicacid,hTR)反义寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotides,ASODN)对顺铂诱导原代白血病细胞凋亡的影响。方法采用与hTR模板互补的硫代ASODN处理原代白血病细胞,采用端粒酶重复扩增分析聚合酶链反应酶联免疫分析法检测端粒酶活性的变化;采用苔盼蓝拒染法观察经hTRASODN处理的原代白血病细胞对顺铂的反应;采用AnnexinV与碘化丙啶双染色观察凋亡细胞形态及用流式细胞仪检测凋亡细胞率。结果经hTRASODN作用后,原代白血病细胞端粒酶活性明显下降。ASODN作用24小时,再加入顺铂作用48小时,明显抑制原代白血病细胞,并使原代白血病细胞凋亡明显增加。ASODN作用24小时后再加入5μmol/L顺铂作用72小时的原代白血病细胞凋亡率为(41±9)%,分别高于正义寡核苷酸加顺铂组[(15±5)%]及单用顺铂组[(13±3)%],差异有统计学意义(均为P<001)。结论hTRASODN可明显抑制原代白血病细胞端粒酶活性,并增强顺铂诱导原代白血病细胞的凋亡,人端粒酶有可能成为白血病基因治疗的新靶点。

原代白血病细胞存活蛋白(Survivin)基因表达与化疗敏感性

为了研究存活蛋白(survivin)基因表达的原代急性白血病(AL)细胞时不同化疗药物的敏感性差异,采用 RT-PCR方法检测AL细胞survivin mRNA的表达,用MTT法检测AL细胞的杀伤率。结果表明:原代AL细胞体 外与不同药物共同孵育15小时后,survivin mRNA(+)AL细胞对DNR、HHT、Acla、AraC、DA(DNR+AraC)、HA (HHT+AraC)的敏感性与survivin mRNA(-)AL细胞无明显差异;survivin mRNA(+)的AL细胞对AA(Acla+ AraC)联合的敏感性显著高于survivin mRNA(-)者[(37.24±18.36)％vs(24.32±9.33)％,P=0.032]。结论: survivin基因阳性表达的AL细胞可能对某些化疗药物(如Acla+MaC)敏感。

原代白血病细胞人端粒酶催化亚单位的表达

目的 :研究原代白血病细胞人端粒酶催化亚单位 (hEST)的表达及其临床意义。方法 :应用RT -PCR方法检测 30例初发急性白血病 (AL)患者、1 2例AL获完全缓解 (CR)患者和 6例正常志愿者骨髓单个核细胞 (MNCs)hESTmRNA的表达。结果 :初发AL患者骨髓MNCshESTmRNA表达量 (0 .71± 0 .34)明显高于CR患者 (0 .4 3± 0 .2 5 ,P <0 .0 5 )及正常志愿者 (0 .2 2± 0 .2 1 ,P <0 .0 1 )。初发AL患者骨髓常规涂片中原始细胞百分率与骨髓MNCs的hESTmRNA表达量呈正相关 (r =0 .4 5 7,P <0 .0 5 )。结论 :初发AL患者骨髓MNCs的hESTmRNA表达增高。

Bcl-2反义核酸联合化疗药对HL60细胞及原代白血病细胞的作用

目的应用Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(anti-sense phosphorothioate oligodeoxynucleotide,AS-PS-ODNs,AS-PO)靶向诱导20例原代急性白血病细胞凋亡,并与多种常用化疗药联合,观察ASPO对原代急性白血病细胞及HL60细胞系的协同效应。方法①应用MTT比色法分析ASPO与常用化疗药物配伍协同作用特点;②细胞免疫化学染色检测P26 Bcl-2蛋白表达;③台盼蓝拒染试验检测白血病细胞倍增时间;④丫啶橙(AO)染色,流式DNA Content分析细胞凋亡率,电镜及DNA电泳观察凋亡细胞形态及分子水平的变化。结果①ASPO与除DNR,NVT外的7种(HHRT,VCR、MTX、Ara-c、VP16、ACR、DEX)化疗药物均有联合增强或相加作用。②12例Bcl-2蛋白抑制率大于0.4为A组,8例小于0.4为B组。A组的凋亡率和B组的凋亡率均高于空白对照组(P<0.05),且A组的凋亡率高于B组(P<0.05)。③原代急性白血病细胞ASPO组,Ara-c组和ASPO+Ara-c组,72 h细胞生长抑制检测发现ASPO+Ara-c组的细胞抑制率高于单用ASPO与单用Ara-c的细胞抑制率之和(P<0.01);④A组的ASPO对细胞的抑制与细胞生长的倍增时间102.89±37.97呈正相关γ=0.577(P<0.05)。结论Bcl-2 ASPO能特异抑制白血病细胞(系)的Bcl-2蛋白表达;Bcl-2 ASPO对倍增时间慢、BCL-2蛋白表达高的原代白血病细胞作用效果好;Bcl-2的ASPO与多种化疗药物联合有潜在临床应用前景。

苦参碱对人原代白血病细胞的体外作用研究

目的研究苦参碱对原代人白血病细胞的体外作用及可能的分子机制。方法取临床初诊的髓系白血病患者外周血,分离得到原代白血病细胞体外培养。不同浓度苦参碱作用后,观察细胞的形态学改变、CCK8法检测细胞增殖、Annexin V-FITC/PI分析细胞凋亡及流式检测细胞周期。结果苦参碱作用24 h,细胞增殖明显受抑,0.5、0.8 mg/m L组的生长抑制率分别为54.98%和72.96%,与对照组相比差异显著(P<0.01),抑制效应有明显剂量相关性。苦参碱作用24 h的IC50为0.5 mg/m L。苦参碱作用24 h,0.2、0.5、0.8 mg/m L组细胞早期凋亡率分别为11.8%、37.6%、54.7%,明显高于对照组自发凋亡率(7.50%)(P<0.05)。苦参碱作用48 h后,细胞周期阻滞于G0/G1→S期。结论苦参碱可显著抑制体外培养的人原代白血病细胞增殖,其机制与诱导细胞早期凋亡,促进细胞周期G1→S期阻滞有关。

阻断泛素-蛋白酶体通路对人原代白血病细胞的作用

阻断泛素-蛋白酶体通路对不同类型细胞具有完全不同的结果,但未见对原代白血病细胞作用的报道.观察了阻断上述通路对8例白血病患者和10例正常人骨髓单个核细胞（MNC）的作用.结果表明,不同个体原代白血病细胞对阻断此通路的反应敏感性存在明显差异,其中3例细胞极为敏感,24h以内90％细胞被迅速诱发凋亡,而正常人骨髓MNC对阻断泛素蛋白酶体通路反应不敏感,未观察到凋亡现象发生.进一步的免疫印迹实验发现,对上述通路敏感的原代白血病细胞Bcl-2蛋白表达量较高,而且在凋亡过程中发生了特异位点的酶解;对上述通路不敏感的细胞（包括正常人骨髓MNC）Bcl-2蛋白低表达,或Bcl-2高表达但未能检测到其特异性酶解现象.结合其他实验结果,提示细胞中Bcl-2蛋白是否发生特异位点酶解与细胞对阻断上述通路的敏感性之间具有相关性,为进一步研究不同种类细胞对阻断泛素-蛋白酶体通路敏感性差异的机制提供了线索.

阿克拉霉素联合阿糖胞苷对survivin基因表达的原代急性白血病细胞增殖的影响

目的探讨survivin基因表达的原代急性白血病(AL)细胞对阿克拉霉素(Acla)联合阿糖胞苷(AraC)的敏感性。方法采用RT-PCR方法检测28例AL患者的原代AL细胞survivinmRNA的表达;用MTT法检测体外Acla4mg/L,AraC20mg/L及2者联用(AA)对AL细胞的生长抑制率。结果28例中,survivinmRNA阳性表达22例。AA应用对survivinmRNA阳性者AL细胞的生长抑制率达(37.24±18.36)%,高于对survivinmRNA阴性者的(24.32±9.33)%(t=2.340,P=0.032)。结论survivin基因阳性表达的原代AL细胞对AA较敏感。

预激态补骨脂素对白血病原代细胞杀伤作用的研究

目的:体外观察预激态补骨脂素(PAP)对白血病原代细胞的杀伤作用。方法:6例临床确诊为白血病的血标本采用体外细胞培养方法,在白血病原代细胞培养板中加入PAP,使其浓度保持在0.05g/L。短期用药PAP浓度维持24h,7天时终止实验;长期用药PAP浓度维持5天,并分别在第7天、第10天、第14天时终止实验。以细胞总数、台盼蓝拒染率和台盼蓝拒染细胞抑制率等作为检测指标,以配对t检验进行组间比较。结果:短期用药和长期用药均显示PAP对白血病原代细胞具有显著杀伤作用。短期用药(≤7天),作用时间延长对PAP杀伤白血病细胞作用的影响不明确。长期用药结果显示台盼蓝拒染细胞抑制率从32.40%～69.50%升至94.10%～98.90%。难治或耐药与否对PAP杀伤白血病细胞作用无明显影响。结论:PAP对白血病原代细胞具有显著的杀伤作用,有可能成为一广谱抗白血病药物。

甲基莲心碱联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病原代细胞Akt/p-Akt蛋白表达的影响

目的探讨甲基莲心碱(Nef)联合伊马替尼(IM)对慢性粒细胞白血病(CML)原代细胞Akt/p-Akt表达的影响。方法采用Western blot法分别检测Akt/p-Akt蛋白的表达水平。结果 Nef(4μmol)、IM(1μmol)单药组与Nef(4μmol)+IM(1μmol)联合用药组,对CML原代细胞Akt蛋白的表达均无影响(P>0.05),而p-Akt蛋白表达均降低,且联合用药组较单药组蛋白表达更低(P<0.05)。结论 Nef联合伊马替尼能够降低CML原代细胞p-Akt蛋白表达,可能是甲基莲心碱增强伊马替尼对CML原代细胞敏感性的机制之一。

BCL-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸对原代急性白血病细胞选择性抑制作用

为探讨BCL-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(AS-PS-ODN,ASPO)对急性原代白血病细胞和正常或良性血液病骨髓细胞的作用是否存在差别。应用台盼蓝拒染试验测定细胞存活力;用造血祖细胞集落培养:粒—单系祖细胞集落(CFU-GM),多向祖细胞集落(CFU-Mix),后红系祖细胞集落(CFU-E)、前红系祖细胞集落(BFU-E)和白血病祖细胞集落(CFU-AML,CFU-ALL)培养检测细胞增殖能力;免疫细胞化学染色检测细胞BCL-2蛋白表达变化。结果发现(1)正常或良性血液病骨髓细胞经10μmol/L ASPO处理一周,同对照组比较:细胞生长数、CFU-GM、CFU-Mix、CFU-E、BFU-E及BCL-2蛋白表达均无显著差别(P<0.05)。(2)急性原代白血病细胞经5μmol/L ASPO处理一周,同对照组比较:细胞生长数显著减低;CFU-AML或CFU-ALL显著降低(P < 0.05),而CFU-GM明显增高(P< 0.05);对照组BCL-2蛋白表达率为77.92％±22.50％,ASPO组于培养的第3天为54.05％±20.20％(P<0.01)和第6天为55.35％±22.74％(P<0.05)均显著低于对照组。因此认为BCL-2ASPO具有选择性地抑制白血病细胞的增殖和BCL-2蛋白的表达的作用。

塞来昔布对急性白血病原代细胞凋亡的影响

目的:探讨塞来昔布对急性白血病原代细胞的增殖抑制与诱导凋亡的作用。方法:采用MTT法检测塞来昔布对急性白血病原代细胞的增殖抑制作用,倒置显微镜观察细胞形态学改变,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:塞来昔布能显著抑制急性白血病原代细胞的增殖,且呈时间和剂量具有依赖性(P<0.05);流式细胞仪结果分析发现,实验组与对照组的凋亡率有显著差异,且实验组的凋亡率明显升高,呈剂量依赖性(P<0.01)。结论:塞来昔布能有效抑制急性白血病原代细胞的增殖并诱导其凋亡,其机制有待进一步研究。

hTERT基因反义核酸促进顺铂诱导原代急性淋巴细胞白血病细胞凋亡的研究

目的 :利用人类端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因的反义寡核苷酸 (ASPS -ODN)抑制人原代急性淋巴细胞白血病 (ALL)细胞hTERT基因表达后 ,观察顺铂对ALL细胞凋亡的影响。方法 :采用间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达量的变化 ;以台盼蓝拒染法计数细胞数 ,确定细胞的增殖情况 ;Hoechst 332 5 8和PI双染色法观察凋亡细胞的形态变化 ;通过流式细胞仪对细胞凋亡峰进行定量分析。结果 :hTERT反义核酸作用于ALL细胞 72hhTERT蛋白表达阳性率为 (32 17± 3 0 0 ) % ,与空白对照组 (6 6 31± 2 84 ) %及正义核酸作用组 (6 2 5 6± 6 11) %比有显著差异 (P <0 0 5 ) ;而正义核酸作用组与空白对照组比无显著差异 (P >0 0 5 )。hTERT反义核酸作用于ALL细胞 2 4h加入顺铂 ,再共同作用 4 8h ,ALL活细胞均数为 1 75 0× 10 8cells/L ,与单用顺铂组 (2 0 90× 10 8cells/L)及hTERT正义核酸联用顺铂组 (1 990× 10 8cells/L)相比 ,对细胞抑制明显增强 (P <0 0 5 )。hTERTASPS -ODN作用于ALL细胞 2 4h再加入顺铂作用 4 8h ,细胞出现典型的凋亡形态学改变。hTERTASPS -ODN与 2 5 μmol/L顺铂联合作用于ALL细胞 4 8h的凋亡细胞百分率 (37 85± 2 4 4 ) %分别同SPS -ODN与顺铂联合作用组 (15 16±2

预激态补骨脂素对白血病原代细胞的杀伤作用

目的体外观察预激态补骨脂素对白血病原代细胞的杀伤作用.方法6例血标本采自住院临床确诊之白血病病例.采用体外细胞培养方法,在白血病原代细胞培养体系内加入预激态补骨脂素,使其浓度保持在0.05 g/L.短期用药实验,这一浓度维持24 h,7 d时终止实验;长期用药实验,这一浓度维持5 d,并分别在7、10、14 d时终止实验.实验均设对照组,以细胞总数、台盼蓝拒染率和台盼蓝拒染细胞抑制率等作为检测指标,以配对t检验进行组间比较.结果短期用药和长期用药均显示预激态补骨脂素对白血病原代细胞具有显著杀伤作用.培养7 d的情况下,用药时间延长对预激态补骨脂素杀伤白血病细胞作用的影响不明确.培养时间从7 d延长至14 d,台盼蓝拒染细胞抑制率从32.40%～69.50%升至94.10%～98.90%,即预激态补骨脂素杀伤白血病细胞作用得到充分表达.难治或耐药与否对预激态补骨脂素杀伤白血病细胞作用无明显影响.培养14 d时,实验组白血病细胞形态发生明显变化;而对照组基本不变,且发现少许贴壁细胞生长,实验组无此现象.结论预激态补骨脂素对白血病原代细胞具有显著的杀伤作用,有可能成为一广谱抗白血病药物.

茅莓总皂苷和高三尖杉酯碱、阿糖胞苷体外协同诱导白血病细胞凋亡的机制研究

目的:探讨茅莓总皂苷(TSRP)抑制K562和人原代白血病细胞及分别与化疗药高三尖杉酯碱(Hom)、阿糖胞苷(Ara-c)的协同作用,并探讨其协同作用的可能机制。方法:MTT法和PHA-LCM液相-半固体二步培养法检测不同浓度的TSRP对K562和人原代白血病细胞增殖及其与化疗药联用后的影响;观察TSRP分别和Hom、Ara-c联用的抑制作用,用药物相互作用指数评价药物协同作用;DAPI染色法观察一定浓度下TSRP协同化疗药诱导K562细胞凋亡;Western blot检测促凋亡蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和Cleaved PARP以及抗凋亡蛋白Survivin的表达。结果:TSRP能够抑制K562和人原代白血病细胞的增殖,呈浓度依赖性,在一定浓度范围内TSRP和化疗药有显著的协同作用;DAPI染色法观察TSRP和化疗药协同较单用化疗药出现明显凋亡现象,诱导细胞发生凋亡;Western blot检测TSRP联合Hom较单用Hom显著提高了K562细胞内PARP、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的活性;TSRP联合Ara-c较单用Ara-c显著提高了K562细胞内PARP和Cleaved caspase-3的活性,但是对Cleaved caspase-9的活性影响差别不大;TSRP联合Hom或Arac对Survivin的活性影响均未见明显差别。结论:TSRP分别和化疗药Hom或Ara-c联用对K562和人原代白血病细胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用,且主要是通过线粒体途径增强凋亡效应,从而增加化疗药物的敏感性,具有良好的临床应用前景。

蝎毒多肽提取物对白血病细胞粘附力影响的实验研究

目的观察蝎毒多肽提取物(PESV,防治白血病中药提取物)对抑制人白血病原代细胞粘附力的影响。方法以人白血病原代细胞为研究对象,台盼蓝拒染法检测PESV对人白血病原代细胞的细胞毒作用;观察其对白血病原代细胞与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)粘附的影响。结果PESV在对细胞最佳作用浓度15μg.mL-1下,能够明显抑制人白血病原代细胞与HU-VEC的粘附,抑制率为(52.18±21.01)%;各浓度组与阳性对照组比较具有显著性差异(P<0.05)。结论PESV在对细胞最佳作用浓度下,对人白血病原代细胞的黏附力有明显抑制作用。

CAV1基因在五种白血病细胞中的表达

目的检测慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者原代肿瘤细胞、SUP-B15细胞、HL-60细胞、K562细胞、THP-1细胞中CAV1的表达情况。方法收集五种肿瘤细胞及正常人白细胞(WBC),使用QRT-PCR、Western印迹法方法分别检测各组细胞中CAV1 mRNA的相对含量及CAV1蛋白表达情况。结果与WBC相比,各肿瘤细胞中CAV1 mRNA均为低表达,表达量由低到高依次为HL-60(0.097±0.02)、CLL(0.1±0.02)、THP-1(0.101±0.02)、K562(0.127±0.04)、SUP-B15(0.311±0.07);与WBC相比,各肿瘤细胞中CAV1蛋白表达均下调。结论与正常人WBC相比,CLL原代肿瘤细胞、HL-60、THP-1、K562、SUP-B15细胞中CAV1 mRNA及蛋白表达均降低,CAV1表达的异常可能出现在转录之前。