刺老苞根皮的4种单体化合物分离制备鉴定及其对原代破骨细胞的影响

目的文章对刺老苞根皮进行化学成分及其对原代破骨细胞影响研究。方法采用大孔吸附树脂、硅胶柱、ODS-C_(18)以及制备型HPLC等方法进行分离纯化,结合理化性质和波谱数据鉴定化合物结构。体外培养原代破骨细胞,采用抗酒石酸酸性磷酸酶阳性染色及骨吸收甲苯胺蓝染色进行鉴定。CCK-8细胞毒性检测法、TRAP阳性细胞数实验及Real-time PCR(RT-PCR)与Western blot法测定骨保护素(osteoprotegerin,OPG)及核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappaB ligand,RANKL)的表达情况检测化合物对破骨细胞的影响。结果成功从刺老苞根皮70%乙醇提取物中分离鉴定了4个化合物,分别是:屏边三七皂苷R_(2)、楤木皂苷C、楤木皂苷A、竹节人参皂苷IVa。在0~50μg·mL^(-1)浓度范围可排除化合物对破骨细胞抑制的假阳性结果。与对照组相比,4个化合物低、中、高浓度(0.5μg·mL^(-1)、5μg·mL^(-1)、50μg·mL^(-1))组OPG mRNA与蛋白表达有所升高,RANKL mRNA与蛋白表达有所降低,破骨细胞数目均有所减少,数据有统计学差异意义(P<0.05或P<0.01)。结论从刺老苞根皮中分离得到的4个单体化合物对原代破骨细胞有一定的抑制活性,为刺老苞根皮治疗骨质疏松症的物质基础研究提供依据。

源于C57BL/6小鼠的原代破骨细胞氯化钴模拟低氧模型的建立

【目的】探索C57BL/6小鼠骨髓来源的原代破骨细胞氯化钴诱导的低氧模型的建立方法。【方法】提取4~6周龄雄性C57BL/6小鼠股骨及胫骨骨髓细胞,通过流式细胞术鉴定单核巨噬细胞(bone marrow-derived mononuclear macrophages,BMMs)表面标记物;BMMs经巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)和核刺激因子-κB受体配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)诱导4 d后,采用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色法观察BMMs向原代破骨细胞诱导分化情况;利用MTT法确定氯化钴(cobalt chloride,CoCl2)模拟原代破骨细胞低氧浓度;运用Western blotting技术检测原代破骨细胞低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)蛋白表达量。【结果】BMMs簇分化抗原11b(cluster differentiation 11b,CD11b)呈强阳性,阳性率为97.90%;BMMs经过M-CSF和RANKL诱导后,产生了大量破骨细胞,TRAP染色为阳性;MTT和Western blotting技术确定原代破骨细胞CoCl2模拟低氧最相似浓度为50μmol/L。【结论】本研究成功地将BMMs诱导分化为破骨细胞,采用50μmol/L的CoCl2可建立该原代破骨细胞的低氧模型。