原代类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞及成熟细胞系生长特性的比较

目的通过对原代类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞及成熟细胞系生长特性进行比较,为类风湿关节炎(RA)研究用细胞提供多重选择。方法分离培养原代类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞,传至第三代,与成熟细胞系镜下观察细胞形态。此外,以相同细胞数接种,观察细胞增殖速度。结果形态上原代类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞与成熟细胞系有所差别,且增殖速度细胞系快于原代细胞。结论成熟细胞系可在一定程度上反映原代细胞的状态,并用于RA相关疾病研究。

miR-let-7d-HMGA2通路调控缺氧诱导的类风湿关节炎滑膜成纤维样细胞增殖

目的 研究缺氧在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)滑膜成纤维样细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)增殖中的作用及机制。方法 采用HE染色法检测RA和对照骨关节炎(osteoarthritis,OA)滑膜组织FLS增生情况。分离原代RA-FLS并采用流式细胞术鉴定;将RA-FLS置于常氧(21%O_(2))或缺氧环境(3%O_(2))中培养,CCK-8法检测细胞增殖水平的变化,RT-PCR检测miR-let-7d表达的变化。通过类似物或抑制物改变miR-let-7d的表达,观察其对RA-FLS增殖、凋亡的影响;探究miR-let-7d靶基因在缺氧诱导的RA-FLS增殖中的作用。结果 FLS在RA滑膜中增生明显,在缺氧环境下RA-FLS增殖加快,miR-let-7d表达水平降低;过表达miR-let-7d抑制RA-FLS增殖,但对细胞凋亡水平无明显影响;进一步的研究证实miR-let-7d靶基因HMGA2参与缺氧诱导的RA-FLS增殖。结论 miR-let-7d-HMGA2通路调控缺氧诱导的RA-FLS增殖。

从NF-κB/Bcl-2信号通路调控成纤维样滑膜细胞凋亡角度探讨中医药抑制类风湿关节炎滑膜炎症机制的研究进展

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎症为主要特征的自身免疫性疾病,成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)的抗凋亡是导致该病病情发展的主要因素。如何促进FLS凋亡并抑制炎症反应是目前RA治疗和研究的重点。核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)/B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)信号通路在RA发病过程中发挥了关键作用,其与FLS炎症倾向、抗凋亡等密切相关。研究并探讨NF-κB/Bcl-2信号通路调控FLS凋亡的机制及作用,介绍中医药靶向该通路促进FLS凋亡进而抑制RA滑膜炎症的研究现状,旨在为中医药治疗RA的研究提供一定基础。

芒果苷抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、迁移及炎性因子的表达

背景:芒果苷是一种从芒果叶、树皮、根中提取的双苯吡酮类化合物,前期研究表明芒果苷可以通过NF-κB、JAK/STAT等转录因子的活化发挥抗全身性炎症作用。目的:探讨芒果苷对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells,RA-FLS)增殖、迁移和炎症因子表达的影响及机制。方法:RA-FLS分为空白组、R848(TLR7/8激动剂)刺激组、芒果苷低、中、高浓度组(2,4,8μg/mL)、阳性对照组(Cu-CPT8,TLR8通路抑制剂)。CCK-8法检测不同质量浓度芒果苷对RA-FLS毒性的影响并筛选最终细胞用药质量浓度,细胞克隆形成实验检测RA-FLS的增殖能力,划痕实验及Transwell迁移实验检测RA-FLS的迁移能力,qRT-PCR检测RA-FLS中白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子αmRNA的表达。结果与结论:①与空白组比较,2-10μg/mL的芒果苷干预组对RA-FLS活力有抑制趋势,但差异不显著(P>0.05),说明对RA-FLS的毒性影响很小;②与R848刺激组比较,芒果苷低、中、高浓度组RA-FLS克隆数、划痕愈合率及迁移细胞数均降低(P<0.01);芒果苷中浓度和高浓度组白细胞介素1β、白细胞介素6及肿瘤坏死因子αmRNA的表达降低(P<0.01);③与R848刺激组比较,阳性对照组细胞克隆数、划痕愈合率及迁移细胞数以及白细胞介素6、肿瘤坏死因子αmRNA表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01);白细胞介素1βmRNA表达水平无明显差异;④结果表明,芒果苷可能通过TLR7/8信号通路抑制RA-FLS增殖、迁移以及炎症因子表达发挥抗类风湿关节炎的作用。

红景天苷调控miR-20a-5p/TIMP2轴对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖和迁移的影响

目的探讨红景天苷调控miR-20a-5p/金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP2)轴对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(HFLS-RA)功能和活化的影响。方法以HFLS-RA细胞为研究对象,将HFLS-RA细胞分为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)组、对照组、红景天苷组、miR-20a-5p抑制物阴性对照(inhibitor NC)组、miR-20a-5p抑制物组、红景天苷+miR-20a-5p模拟物阴性对照(mimic NC)组、红景天苷+miR-20a-5p模拟物组。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测HFLS-RA细胞中miR-20a-5p表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HFLS-RA细胞上清液中白细胞介素(IL)-1β、IL-6水平;细胞计数试剂盒8(CCK-8)法、5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)染色检测HFLS-RA细胞增殖;划痕实验检测HFLS-RA细胞迁移;免疫印迹实验(Western blot)检测HFLS-RA细胞中TIMP2、细胞周期素D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶(MMP)-9蛋白表达;双荧光素酶验证miR-20a-5p与TIMP2的关系。结果与对照组比较,TNF-α组miR-20a-5p表达、IL-1β、IL-6水平、吸光度(OD_(450))值、EdU阳性细胞率、划痕愈合率及CyclinD1、MMP-9蛋白上调,TIMP2蛋白下调(P<0.05);与TNF-α组相比,红景天苷组miR-20a-5p表达、IL-1β、IL-6水平、OD_(450)值、EdU阳性细胞率、划痕愈合率及CyclinD1、MMP-9蛋白下调,TIMP2蛋白上调(P<0.05);与inhibitor NC组、TNF-α组相比比较,miR-20a-5p抑制物组miR-20a-5p表达、IL-1β、IL-6水平、OD_(450)值、EdU阳性细胞率、划痕愈合率及CyclinD1、MMP-9蛋白下调,TIMP2蛋白上调(P<0.05);与红景天苷+mimic NC组、红景天苷组相比,红景天苷+miR-20a-5p模拟物组miR-20a-5p表达、IL-1β、IL-6水平、OD_(450)值、EdU阳性细胞率、划痕愈合率及CyclinD1、MMP-9蛋白表达升高,TIMP2蛋白表达降低(P<0.05)。miR-20a-5p与TIMP2存在靶向调控关系。结论红景天苷可能通过调控miR-20a-5p/TIMP2抑制TNF-α诱导的HFLS-RA细胞增殖、迁移及炎症反应。

lncRNA SNHG16通过miR-182-5p/PPARG轴调控类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖和侵袭

目的:确定小核仁RNA宿主基因16(SNHG16)在类风湿关节炎(RA)患者成纤维样滑膜细胞(FLS)中的表达及其在RA发展中的作用。方法:RT-qPCR用于测量SNHG16、miR-182-5p和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARG) mRNA表达;双荧光素酶实验用于检测SNHG16、miR-182-5p和PPARG mRNA的相互作用关系;EdU和Transwell用于检测细胞增殖、侵袭;Western blot用于检测PPARG蛋白水平。结果:RA滑膜组织和人RA-FLS系(HFLS-RA)中SNHG16和PPARG mRNA表达上调,miR-182-5p表达下调。SNHG16负靶向调节miR-182-5p表达,正调节PPARG(miR-182-5p靶标)表达。沉默SNHG16抑制HFLS-RA增殖、侵袭;下调miR-182-5p部分逆转SNHG16沉默对细胞增殖、侵袭的抑制作用;过表达PPARG部分逆转miR-182-5p上调对HFLS-RA增殖、侵袭的抑制作用。结论:沉默SNHG16靶向miR-182-5p/PPARG轴抑制HFLS-RA的增殖、侵袭。

独活寄生汤对TNF-α诱导的类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、凋亡和炎症的影响

目的探究独活寄生汤含药血清对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的类风湿性关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLS)增殖、凋亡和炎症的影响及作用机制。方法将MH7A细胞分为正常组(10%空白血清)、模型组(10μg·L^(-1) TNF-α+10%空白血清)、独活寄生汤低(10μg·L^(-1) TNF-α+2.5%含药血清+7.5%空白血清)、中(10μg·L^(-1) TNF-α+5%含药血清+5%空白血清)、高(10μg·L^(-1) TNF-α+10%含药血清)剂量组共5组;MTT法筛选独活寄生汤含药血清给药浓度;EdU染色检测细胞增殖情况;免疫荧光染色检测增殖标志物Ki67表达情况;流式细胞仪检测细胞凋亡率;ELISA法检测细胞中IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10的含量;RT-qPCR和Western blot检测Bax、Bcl-2、caspase-3及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路mRNA和蛋白的表达情况。结果与正常组比较,模型组细胞增殖水平明显上升,凋亡水平明显减弱,IFN-γ和IL-6的含量升高,IL-4和IL-10的含量减少,TLR4/MyD88/NF-κB信号通路被激活;经独活寄生汤含药血清低、中、高剂量组干预后,均能有效改善细胞异常增殖情况,增强细胞凋亡,抑制炎性反应和TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活。结论独活寄生汤含药血清能够抑制TNF-α诱导的RA-FLS异常增殖和促炎因子的分泌,增强细胞凋亡和抗炎水平,其作用机制可能与调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路有关。

独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的影响

背景:独活寄生汤是治疗类风湿关节炎的经典方剂,但具体作用机制尚不清楚,细胞外囊泡具有细胞间通讯及传递信号的强大功能,可能是该方剂发挥作用的信号载体。目的:探讨独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响。方法:肿瘤坏死因子α体外诱导构建类风湿关节炎滑膜成纤维细胞模型,实验分为5组:正常组、模型组、独活寄生汤含药血清组、独活寄生汤含药血清细胞外囊泡组、生理盐水血清细胞外囊泡组。采用CCK-8法筛选独活寄生汤含药血清及独活寄生汤含药血清细胞外囊泡作用的最佳浓度及时间;ELISA检测细胞上清炎症因子水平;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力及迁移能力;Hoechst染色检测细胞凋亡情况;qRT-PCR及Western blot检测细胞凋亡相关基因及蛋白表达。结果与结论:(1)独活寄生汤含药血清作用的最佳体积分数为10%,独活寄生汤含药血清细胞外囊泡作用的最佳质量浓度为10 ng/mL,二者作用的最佳时间均为24 h;(2)与模型组相比,独活寄生汤含药血清、独活寄生汤含药血清细胞外囊泡及生理盐水血清细胞外囊泡均能抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的炎症因子表达(P<0.05)、划痕愈合(P<0.05)、迁移及侵袭(P<0.05),且独活寄生汤含药血清细胞外囊泡的抑制作用更为突出(P<0.05);(3)独活寄生汤含药血清及独活寄生汤含药血清细胞外囊泡均可促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的凋亡;(4)与模型组相比,独活寄生汤含药血清、独活寄生汤含药血清细胞外囊泡及生理盐水血清细胞外囊泡均可增加促凋亡因子Caspase-3、Caspase-9、Bax表达(P<0.05),降低抑凋亡因子Bcl-2表达(P<0.05),且独活寄生汤含药血清细胞外囊泡对凋亡相关因子的调节作用更显著。上述实验结果表明独活寄生汤含药血清细胞外囊泡可以抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的过度增殖、迁移、侵袭并促进其凋亡。

低强度脉冲超声通过p38/JNK-白细胞介素-6抑制类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞增殖的研究

目的:探讨低强度脉冲超声(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞(fibroblastlike synoviocytes in rheumatoid arthritis,RA-FLS)异常细胞表型的抑制作用及可能机制。方法:酶消化法分离滑膜细胞,显微镜下观察细胞形态,同时用免疫荧光检测Vimentin蛋白表达来鉴定RA-FLS。将细胞进行体外培养并分为4组:对照组、LIPUS组、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)组和TNF-α+LIPUS组或3组:对照组、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)组和IL-6+LIPUS组。CCK8和EDU实验分别检测LIPUS对RA-FLS细胞活性和增殖的作用,划痕实验和Transwell迁移实验观察LIPUS对RA-FLS迁移能力的影响,RT-q PCR检测RA-FLS中重要的细胞因子、趋化因子和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的基因表达,ELISA进一步检测LIPUS对RA-FLS中关键效应分子IL-6蛋白水平的作用,Western Blot检测LIPUS对RAFLS中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路的影响。结果:分离得到较纯净的RA-FLS。在体外培养的RA-FLS中,首先,LIPUS可以抑制TNF-α诱导的细胞活性(P<0.001)和增殖(P=0.007),但它对其迁移及迁移相关MMPs(MMP2和MMP9)转录水平的作用在组间无显著性差异(P>0.05)。在TNF-α诱导的炎性环境下,LIPUS能够抑制IL-6和白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)在m RNA水平上的高表达(P<0.001),但其对白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、MMP1和MMP13的抑制作用在组间无显著性差异(P>0.05)。与未处理组相比,LIPUS抑制TNF-α诱导的RA-FLS中IL-6的分泌(P<0.001),同时也抑制IL-6诱导的RA-FLS增殖(P=0.003)。LIPUS能够抑制MAPK信号通路中p38 MAPK(P=0.033)的磷酸化和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)的磷酸化(P=0.019),但其对细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signalregulated kinas 1/2,ERK1/2)蛋白的磷酸化则无显著作用(P>0.05)。结论:LIPUS能够减少炎性状态下RA-FLS的异常增殖而不作用于其迁移,该作用可能与p38/JNK-IL-6信号通路的抑制有关。

环状RNA_0032131靶向微小RNA-145-5p调控类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的增殖、迁移和侵袭

目的探讨环状RNA_003213(hsa_circ_003213)靶向微小RNA-145-5p(miR-145-5p)对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RA-FLSs)增殖、迁移和侵袭的影响。方法检测RA患者和健康体检者外周血、RA-FLSs、人正常滑膜成纤维细胞中hsa_circ_0032131和miR-145-5p的水平。将RA-FLSs分为对照(NC)组、si-NC组、si-hsa_circ_0032131组、miR-NC组、miR-145-5p组、anti-miR-NC+si-hsa_circ_0032131组、anti-miR-145-5p+si-hsa_circ_0032131组、pcDNA组、pcDNA-hsa_circ_0032131组。采用CCK-8和Transwell法检测RA-FLSs活力、迁移和侵袭数。通过双荧光素酶报告实验确定hsa_circ_0032131与miR-145-5p的靶向关系。结果与健康体检者相比,RA患者外周血中hsa_circ_0032131表达增加,miR-145-5p表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与人正常滑膜成纤维细胞相比,RA-FLSs中hsa_circ_0032131表达增加,miR-145-5p表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与NC组比较,si-hsa_circ_0032131组RA-FLSs的活力和迁移、侵袭数目降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-145-5p组RA-FLSs的活力和迁移、侵袭数目降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与anti-miR-NC+si-hsa_circ_0032131组比较,anti-miR-145-5p+si-hsa_circ_0032131组RA-FLSs的活力和迁移、侵袭数目增高,差异有统计学意义(P<0.05)。与pcDNA组比较,pcDNA-hsa_circ_0032131组RA-FLSs中miR-145-5p水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-145-5p是hsa_circ_0032131的直接靶点。结论敲低hsa_circ_0032131通过上调miR-145-5p抑制RA-FLSs的增殖、迁移和侵袭。

LncRNA MIR22HG通过海绵吸附miR-22-5p对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、凋亡和炎性反应的影响

目的探讨长链非编码RNA(LncRNA)MIR22HG对类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLSs)增殖、凋亡和炎性反应的影响及其分子机制。方法收集在本院接受治疗的37例RA患者及30例关节创伤患者的滑膜组织样本,采用qRT-PCR检测滑膜组织中MIR22HG和miR-22-5p表达水平。体外分离、培养和鉴定人RA-FLSs,将MIR22HG siRNA干扰质粒(si-MIR22HG)及其阴性对照质粒(si-NC)和miR-22-5p inhibitor及其阴性对照(inhibitor-NC)分别或同时转染至RA-FLSs中,qRT-PCR检测细胞中MIR22HG和miR-22-5p表达水平;CCK-8检测各组细胞增殖活性;Annexin Ⅴ-FITC/PI检测各组细胞凋亡率;ELISA检测各组细胞上清液中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和IL-6水平;Western blot检测各组细胞中Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证MIR22HG与miR-22-5p之间的靶向关系。结果与关节创伤患者比较,RA患者滑膜组织中MIR22HG表达水平升高(P<0.05),而miR-22-5p表达水平降低(P<0.05)。干扰MIR22HG可抑制RA-FLSs增殖活性,降低细胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平及细胞中Bcl-2蛋白表达水平(P<0.05),提高细胞凋亡率、miR-22-5p及Bax、Cleaved casepase-3等蛋白表达水平(P<0.05)。然而,抑制miR-22-5p表达可逆转MIR22HG基因沉默对RA-FLSs增殖、凋亡和炎症的影响(P<0.05)。双荧光素酶报告实验显示,miR-22-5p是MIR22HG潜在的下游靶miRNA。结论MIR22HG在RA患者关节滑膜组织中高表达,其可能通过靶向下调miR-22-5p表达促进RA-FLSs增殖及炎性反应,并抑制细胞凋亡。

抑制LINC00667表达对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、迁移、侵袭的影响

目的探究长链非编码RNA(LncRNA)LINC00667对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)增殖、迁移、侵袭的影响及其机制。方法复制类风湿关节炎(RA)模型大鼠,SPF级Wistar大鼠分离踝关节滑膜组织,用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测RA-FLS中LINC00667和miR-19a-3p的表达。在RA-FLS中分别转染si-NC(si-NC组)、si-LINC00667(si-LINC00667组)、miR-NC(miR-NC组)、miR-19a-3p模拟物(miR-19a-3p组)、si-LINC00667与anti-miR-NC(si-LINC00667+anti-miR-NC组)、si-LINC00667与anti-miR-19a-3p(si-LINC00667+anti-miR-19a-3p组)。CCK-8法检测各组转染后RA-FLS的增殖抑制率。Transwell法检测RA-FLS迁移、侵袭。Westernblotting检测E钙黏蛋白(Ecadherin)、N钙黏蛋白(N-cadherin)表达。双萤光素酶报告验证LINC00667和miR-19a-3p的靶向关系。结果RA模型组滑膜组织中LINC00667表达量约为正常组的270%,miR-19a-3p表达量约为正常组的36%(P<0.05)。转染成功后,si-LINC00667组RA-FLS的增殖抑制率、E-cadherin蛋白相对表达量高于si-NC组(P<0.05),si-LINC00667组迁移、侵袭细胞数、N-cadherin蛋白相对表达量低于si-NC组(P<0.05)。LINC00667靶向miR-19a-3p,miR-19a-3p组RA-FLS的增殖抑制率、E-cadherin蛋白相对表达量高于miR-NC组(P<0.05),miR-19a-3p组迁移、侵袭细胞数、N-cadherin蛋白相对表达量低于miR-NC组(P<0.05)。si-LINC00667+anti-miR-19a-3p组RA-FLS的增殖抑制率、E-cadherin蛋白相对表达量低于si-LINC00667+anti-miR-NC组(P<0.05),si-LINC00667+anti-miR-19a-3p组迁移、侵袭细胞数、Ncadherin蛋白相对表达量高于si-LINC00667+anti-miR-NC组(P<0.05)。结论抑制miR-19a-3p通过靶向LINC00667,抑制RA-FLS的增殖、迁移、侵袭,LINC00667或可用作诊断和治疗RA的靶点。

淫羊藿苷通过上调TRIB1抑制核转录因子-κB缓解类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞炎症

目的:探讨淫羊藿苷(ICA)是否通过上调TRIB1表达抑制核转录因子-κB(NF-κB)缓解类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)炎症。方法:收集南昌大学第一附属医院接受膝关节置换手术的活动期类风湿关节炎(RA)患者的滑膜组织,分离培养RA-FLS后,用肿瘤坏死因子-α(TNF-α,10 ng·mL-1)处理RA-FLS建立炎症细胞模型。首先,为明确ICA抑制RA-FLS增殖和炎症,促进细胞凋亡,分为空白对照组、TNF-α组、TNF-α+ICA组;然后,为明确TRIB1过表达可抑制RA-FLS的增殖和炎症,促进细胞凋亡,空白vector或oe-TRIB1转染TNF-α处理的RA-FLS,分为空白对照组、TNF-α组、TNF-α+vector组、TNF-α+TRIB1组;接着,为明确ICA以依赖于TRIB1的方式抑制NF-κB,siTRIB1转染TNF-α处理的RA-FLS细胞,分为空白对照组、TNF-α组、TNF-α+ICA组、TNF-α+ICA+siTRIB1组。分别采用qRT-PCR、Western blot检测基因和蛋白水平;ELISA检测炎性细胞因子;CCK-8、流式细胞术检测细胞增殖和凋亡。结果:ICA处理和TRIB1过表达均抑制TNF-α诱导的RA-FLS的增殖和炎症反应,且促进其凋亡。TNF-α处理后RA-FLS中p-p65和p-IκB水平显著上调,但ICA显著降低p-p65和p-IκB水平;且与siTRIB1联合治疗时,ICA的抑制作用消失。结论:ICA通过上调TRIB1抑制NF-κB缓解RA,提示ICA可能是一种有前景的治疗RA药物。

miR-93-5p靶向下调ROCK2表达对类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的:探讨miR-93-5p对类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLSs)增殖、迁移和侵袭的影响,并阐明其可能的机制。方法:选择类风湿性关节炎(RA)患者(RA组,n=37)和接受关节置换手术的关节创伤患者(对照组,n=30)作为研究对象,从RA患者滑膜组织分离出RA-FLSs,采用免疫荧光法和流式细胞术鉴定细胞。将RA-FLSs分为空白组、mimics NC组(转染miR-93-5p mimics NC)、mimics组(转染miR-93-5p mimics)、OE-NC组(转染ROCK2过表达空载质粒)、OE-Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶(ROCK)2组(转染ROCK2过表达质粒)、mimics+OE-NC组(共转染miR-93-5p mimics和ROCK2过表达空载质粒)和mimics+OE-ROCK2组(共转染miR-93-5p mimics和ROCK2过表达质粒)。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组患者滑膜组织和各组细胞中miR-93-5p和ROCK2 mRNA表达水平,CCK-8法检测各组细胞增殖活性,EdU染色检测各组细胞中EdU阳性细胞率,Transwell小室实验检测各组RA-FLSs迁移和侵袭数,Western blotting法检测各组细胞中ROCK2、Ki-67、增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白表达水平,双荧光素酶报告基因实验验证miR-93-5p与ROCK2之间的靶向关系。结果:免疫荧光法检测,Vimentin蛋白表达呈阳性。流式细胞术检测,第3代RA-FLSs表面CD55呈阳性表达,CD14和CD68呈阴性表达,证实分离的细胞为RA-FLSs。RT-qPCR法检测,与对照组比较,RA组患者滑膜组织中miR-93-5p表达水平明显降低(P<0.01),ROCK2 mRNA表达水平明显升高(P<0.01)。与空白组和mimics NC组比较,mimics组细胞中miR-93-5p表达水平明显升高(P<0.01),ROCK2 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。CCK-8法和EdU染色检测,与mimics NC组比较,mimics组细胞增殖活性和EdU阳性细胞率明显降低(P<0.01),OE-ROCK2组细胞增殖活性和EdU阳性细胞率明显升高(P<0.01);与mimics组比较,mimics+OE-ROCK2组细胞增殖活性和EdU阳性细胞率明显升高(P<0.01)。Transwell小室实验检测,与mimics NC组比较,mimics组RA-FLSs的迁移和侵袭数明显减少(P<0.01),OE-ROCK2组RA-FLSs的迁移和侵袭数明显增加(P<0.01);与mimics组比较,mimics+OE-ROCK2组RA-FLSs的迁移和侵袭数明显增加(P<0.01)。Western blotting法检测,与mimics NC组比较,mimics组细胞中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平明显降低(P<0.01),OE-ROCK2组细胞中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平明显升高(P<0.01);与mimics组比较,mimics+OE-ROCK2组细胞中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。miR-93-5p与ROCK2-3’-UTR之间存在靶向结合位点。双荧光素酶报告实验验证转染miR-93-5p mimic可明显降低ROCK野生型(ROCK2-WT)组细胞中荧光素酶活性(P<0.01)。结论:过表达miR-93-5p通过靶向下调ROCK2表达抑制RA-FLSs的增殖、迁移和侵袭。

关节滑液富集的CC趋化因子配体18通过促进类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞迁移参与关节破坏

目的 评估类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)关节滑液富集的CC趋化因子配体18(CC chemokine ligand 18,CCL18)与关节破坏的相关性及其可能机制。方法 纳入2018年1月至2023年4月于中山大学孙逸仙纪念医院风湿免疫科就诊的处于疾病活动期的RA患者并随访1年,比较有或无放射学进展者基线关节滑液CCL18水平的差异。体外细胞实验明确关节滑液富集的CCL18或重组CCL18对RA-成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)或健康FLS(healthy FLS,HFLS)迁移的影响。结果 RA滑液CCL18显著高于配对的血清[差值为(806±609)ng/ml,P<0.001],有1年放射学进展者基线关节滑液CCL18水平显著高于无放射学进展者[(914±166)ng/ml比(264±72)ng/ml,P<0.001]。RA患者滑膜组织多重免疫荧光染色及公开的单细胞测序平台示滑膜CCL18主要由滑膜巨噬细胞产生。使用RA患者滑液预处理24h可激活RA-FLS的迁移活性,而CCL18中和抗体可使RA-FLS迁移率降低40%(P<0.001)。重组CCL18既直接激活RA-FLS或HFLS的迁移活性,又可在Transwell下室发挥趋化作用,两种作用可叠加。采用Oris动态迁移实验连续观察60h,CCL18激活RA-FLS迁移活性呈剂量和时间依赖性。进一步行高通量测序示重组CCL18诱导HFLS产生与RA-FLS相似的基因转录谱。实时荧光定量聚合酶链反应验证,CCL18干预的HFLS中ANXA2、THBS1、TAGLN、NNMT、CDH11、HSPB1、TRIM8、SUMO1等8个与迁移相关基因表达上调。结论 RA滑液富集的CCL18主要由滑膜巨噬细胞产生并通过促进RA-FLS迁移参与关节破坏。

羊踯躅含药血清对TNF-α诱导的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖及炎症因子分泌的影响

目的探究羊踯躅含药血清对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导的类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA-FLS)增殖和炎症因子分泌的影响和作用机制,为临床治疗RA提供理论及实验依据。方法将细胞分为空白组、模型组、雷公藤多苷组、5%和10%空白血清组及5%和10%羊踯躅含药血清组。RA-FLS经TNF-α(10 ng/mL)处理24 h以构建RA细胞模型。CCK-8检测细胞增殖情况。采用ELISA检测炎症因子白细胞介素-1β(interleukin-1 beta,IL-1β)、白细胞介素-17A(interleukin-17A,IL-17A)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)和γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)的含量。Western blot检测蛋白激酶B(protein kinase B,AKT1)、磷酸化AKT1(phosphorylated AKT1,p-AKT1)、原癌基因c-JUN、p-c-JUN、p65、p-p65、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)蛋白表达水平。结果与未用羊踯躅含药血清处理的正常RA-FLS相比,用5%和10%羊踯躅含药血清处理的细胞增殖活性在48 h内没有明显的变化(P>0.05),而用20%和30%羊踯躅含药血清处理的细胞增殖活性明显降低(P<0.05)。与空白组相比,模型组的细胞增殖活性显著上升(P<0.05);与5%和10%空白血清组相比,5%和10%羊踯躅含药血清组的细胞增殖活性均显著降低(P<0.05)。与空白组相比,模型组的IL-1β、IL-17A、IL-6、IL-2和IFN-γ水平均明显升高(P<0.05);与5%和10%空白血清组相比,5%和10%羊踯躅含药血清组的IL-1β、IL-17A、IL-6、IL-2和IFN-γ水平明显下降(P<0.05)。与空白组相比,模型组的EGFR表达量以及AKT1、c-JUN和p65的磷酸化水平均明显升高(P<0.05);与5%和10%空白血清组相比,5%和10%羊踯躅含药血清组的EGFR表达量以及AKT1、c-JUN和p65的磷酸化水平显著降低(P<0.05)。此外,10%羊踯躅含药血清的效果比5%羊踯躅含药血清更为显著(P<0.05)。结论羊踯躅含药血清能抑制TNF-α诱导的RA-FLS增殖及促炎因子的分泌,其机制可能与调控EGFR、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、AKT和c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路有关。

兔膝骨关节炎成纤维样滑膜细胞分离培养方法的研究

目的在传统细胞组织块培养方法的基础上进行改进,建立一种简单、可重复性操作的兔膝骨关节炎成纤维样滑膜细胞分离培养方法。方法通过手术诱导建立兔膝骨关节炎模型,在无菌条件下,快速取出兔膝骨关节炎的滑膜组织,经过冲洗处理后剪成一定大小碎片,用无菌滤纸吸净组织上附着的水分,接种在培养皿后,进行观察、换液、传代、拍照。将原代培养的细胞传至第三代细胞接种于96孔板中,采用噻唑蓝(MTT)法分别在不同时间梯度检测各孔对应吸光度,制作生长曲线;采用免疫荧光染色法观察细胞中波形蛋白的表达情况。结果培养的细胞为典型的梭形,符合成纤维样滑膜细胞的生长形态特征,免疫荧光染色显示波形蛋白强表达。结论改进后的组织块培养方法简单、操作可重复性强,可以获得大量兔膝骨关节炎成纤维样滑膜细胞,为后续膝骨关节炎的机理研究提供了大量细胞支持。

当归补血汤含药血清抑制JAK2/STAT1/3信号通路诱导人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的机制研究

目的基于JAK2/STAT1/3信号通路探讨当归补血汤含药血清对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(HFLS-RA)增殖、凋亡的影响及机制。方法将Wistar大鼠随机分为空白组、雷公藤多苷组(9.45 mg·kg^(-1))及当归补血汤高、中、低剂量组(15、7.5、3.75 g·kg^(-1)),连续灌胃给药7 d,制备大鼠空白血清及含药血清。将HFLS-RA细胞随机分为6组,即空白组(10%空白组大鼠血清培养基)、模型组(20 ng·mL^(-1)TNF-α+10%空白组大鼠血清培养基)、雷公藤多苷组(20 ng·mL^(-1)TNF-α+10%雷公藤多苷组大鼠血清培养基),以及当归补血汤含药血清低、中、高剂量组(20 ng·mL^(-1)TNF-α+10%当归补血汤低、中、高剂量组大鼠血清培养基);按照分组设置加入终质量浓度为20 ng·mL^(-1)的TNF-α,1 h后加入相应含药(或空白)血清处理24 h。采用CCK-8法检测HFLS-RA细胞增殖活性;流式细胞术(Annexin V-FITC/PI双染法)检测HFLS-RA细胞凋亡情况;RT-PCR法检测细胞中Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA表达;ELISA法检测细胞上清液中白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素15(IL-15)水平;Western Blot法检测细胞中Bax、Bcl-2、caspase-3、p-JAK2、p-STAT3、p-STAT1蛋白表达水平。结果与空白组比较,模型组HFLS-RA细胞的增殖活性显著升高(P<0.01),细胞凋亡率明显下降(P<0.05),IL-6、IL-15水平显著升高(P<0.01);Bax、caspase-3 mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.01),而Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01),Bax/Bcl-2比值显著降低(P<0.01);细胞p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,雷公藤多苷组及当归补血汤含药血清各剂量组HFLS-RA细胞的增殖活性均显著降低(P<0.01),细胞凋亡率显著升高(P<0.05,P<0.01),IL-6、IL-15水平均显著降低(P<0.01);Bax、caspase-3mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.01),而Bcl-2 mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01),Bax/Bcl-2比值显著升高(P<0.01);当归补血汤含药血清中、高剂量组HFLS-RA细胞的p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)。结论当归补血汤含药血清对TNF-α诱导HFLS-RA细胞增殖有显著的抑制作用,并可促使其凋亡,其机制可能与抑制JAK2/STAT1/3信号通路转导有关。

人参皂苷CK对佐剂性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞凋亡/自噬的调控作用

目的基于PKM2/mTOR信号通路探讨人参皂苷CK(ginsenoside compound K,CK)对大鼠成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)凋亡/自噬的调控作用和机制。方法将SD大鼠分为正常组(n=10)、模型组(n=10),CK组(n=10)和甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)组(n=10)。大鼠右后足跖皮内注射10 mg/mL弗氏完全佐剂(complete Freund adjuvant,CFA)0.1 mL,制备大鼠AA模型。注射免疫后第15天开始,CK组每天灌胃给药80 mg/kg CK,连续18 d;MTX组每天灌胃给药0.5 mg/kg MTX,每3 d给药一次。每3 d记录大鼠体质量,全身关节炎评分,关节炎指数和足爪肿胀度;计算脾脏和胸腺指数;Western blot检测FLS凋亡和自噬相关蛋白及PKM2和mTOR通路相关蛋白的表达;过表达质粒试剂盒检测FLS自噬流;流式细胞术检测FLS凋亡。结果与AA组比较,CK组和MTX组全身炎症评分、关节炎指数、足爪肿胀度和脾脏指数明显降低(P<0.05),Bax、p62和p-mTOR/mTOR的蛋白水平显著上调(P<0.05),Beclin1、Bcl-2和PKM2的蛋白水平显著下调(P<0.05),FLS凋亡率升高(P<0.05),自噬小体减少。MTX组和CK组全身炎症评分、关节炎指数、足爪肿胀度和脾脏指数的差异无统计学意义(P>0.05)。结论CK可能通过PKM2/mTOR信号通路调节大鼠FLS凋亡/自噬缓解AA大鼠关节炎症。

黄芩苷调节let-7i-3p/PI3K/Akt/NF-κB信号轴减轻类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞NLRP3炎性小体活化

目的研究黄芩苷减轻类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(human fibroblast like synoviocytes of rheumatoid arthritis,HFLS-RA)NLRP3炎性小体活化的作用及机制。方法为证实黄芩苷减轻HFLS-RA中NLRP3炎性小体活化,采用免疫荧光观察黄芩苷处理前后NLRP3的表达;Western blot检测黄芩苷处理48 h后,p-PI3K、p-Akt、NF-κB p65、NLRP3、ASC及caspase-1蛋白的表达;ELISA检测细胞上清中IL-1及IL-18的含量。为探究黄芩苷减轻NLRP3炎性小体活化的机制,采用双荧光素酶及Western blot验证let-7i-3p与PIK3CA的对应关系;RT-qPCR检测黄芩苷干预前后let-7i-3p及PI3K的表达;采用let-7i-3p干扰,验证黄芩苷是否减轻了增强的NLRP3炎性小体的活化。结果50、100 mg·L^(-1)黄芩苷明显减轻了NLRP3炎性小体的活化,抑制p-PI3K、p-Akt、NF-κB p65、NLRP3、ASC、caspase-1蛋白的表达,抑制IL-1、IL-18的分泌。let-7i-3p与PIK3CA存在靶向对应关系,黄芩苷上调了let-7i-3p的表达、下调了PIK3CA的表达;黄芩苷减轻了因let-7i-3p干扰而增强的NLRP3炎性小体的活化。结论黄芩苷经上调let-7i-3p表达、抑制PI3K/Akt/NF-κB信号转导,从而减轻NLRP3炎性小体的活化。