基于骨髓间充质干细胞分离培养的原代细胞培养技术在细胞生物学实验课程中的应用和思考

细胞是生命活动的基本结构和功能单位,细胞生物学各项研究的开展都离不开细胞。细胞培养是开展细胞生物学研究的基础,也是生物学最基本的实验操作技术之一。原代细胞培养是获取细胞的主要手段,将基于骨髓间充质干细胞分离培养的原代培养技术纳入细胞生物实验课程中,可以加深学生对骨髓间充质干细胞多潜能性分化的认识,巩固学生培养细胞的科研能力,激发学生的多元实验设计思维和开展综合性创新实验的动力。

用原代细胞培养和人全基因表达谱芯片筛选鼻咽癌差异表达基因

目的利用细胞的原代培养技术及人全基因表达谱芯片技术初步筛选出鼻咽癌差异表达基因,以发现与鼻咽癌发生、发展相关的新的候选基因。方法分别用1例鼻咽癌细胞株C666及5例鼻咽癌培养出的原代细胞和3例鼻咽正常上皮的原代细胞,进行基因表达谱分析,并以荧光定量PCR及免疫组织化学验证芯片结果。结果原代培养的鼻咽癌细胞和鼻咽正常上皮细胞通过细胞角蛋白的免疫细胞化学染色、EBER1原位杂交和EBV-DNA荧光定量PCR证实;鼻咽癌原代细胞和鼻咽正常上皮原代细胞的基因表达谱有显著差异;4例以上共同表达的差异基因有493个,包括上调基因264个,下调基因229个。荧光定量PCR及免疫组织化学结果和芯片结果一致。结论用原代培养细胞及人类全基因组基因芯片构建基因表达谱能够准确、高效地筛选出鼻咽癌相关的差异表达基因,该基因表达谱的建立为研究鼻咽癌分子生物学机制、鼻咽癌的分子分型和分子诊断提供了重要的分子依据。

胃肠道肿瘤冻存组织原代细胞培养的实验研究

目的探讨冻存胃肠道肿瘤组织复苏后原代细胞培养的可行性方法。方法采用胎牛血清、RPMI Medium 1640培养液、二甲基亚砜(DMSO)配制冻存液,复苏以此冻存液冷冻保存的8例胃肠道肿瘤组织并行原代细胞培养,另复苏2例未加冻存液直接冻存的胃肠肿瘤组织为对照组。结果8例冻存液保存的胃肠道肿瘤组织原代细胞培养均获成功,成功率为100%。对照组2例未加冻存液冻存的肿瘤组织培养失败。结论 复苏应用冻存液冻存的胃肠道肿瘤组织进行原代细胞培养可获得成功,细胞生长时间与冻存时间及肿瘤细胞恶性程度有关,采用高浓度血清冷冻保存效果较好。

简便人大肠癌原代细胞培养方法的探讨

目的探讨简便、实用的人大肠癌原代细胞培养方法。方法在培养瓶底放置经过高浓度抗生素和两性霉素B反复处理的约1 mm3大小的人大肠癌组织块数个,加入2 ml含高浓度抗生素和两性霉素B的RPMI 1640培养液,直立培养7～10 h,轻轻放平培养24 h后再加入2 ml高浓度抗生素和两性霉素B的RPMI 1640培养液,至大量肿瘤细胞培养出来。结果肿瘤细胞在3～4 d后从组织块内爬出,贴壁大量生长,细胞融合成片,蔓延至整个瓶底。结论 利用简便易行的方法对大肠癌新鲜标本进行原代细胞培养可以得到存活的肿瘤细胞。

中华蜜蜂幼虫原代细胞培养及中华蜜蜂囊状幼虫病毒在培养的细胞中的复制

【目的】建立一种适用于蜜蜂源的细胞培养方法,为蜜蜂源细胞培养和蜂病毒的研究奠定基础。【方法】比较在Grace和WH2两种昆虫细胞培养基中培养的中华蜜蜂Apis cerana cerana幼虫原代细胞状况,筛选出适用于中华蜜蜂幼虫原代细胞培养的最佳培养基,并通过细胞活力比较,确定用于中华蜜蜂幼虫原代细胞培养的适宜胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）浓度。在此基础上,用该原代细胞接种中华蜜蜂囊状幼虫病毒（Chinese sacbrood bee disease,CSBV）,并通过实时定量RT-PCR方法对病毒复制情况进行检测。【结果】相对于WH2培养基,在Grace培养基中生长的细胞大而圆,透明,边缘整齐,无颗粒物,活力明显高于WH2培养,且含15%FBS的Grace培养基更适合于中华蜜蜂幼虫原代细胞培养。CSBV接种在该原代细胞,能够复制增殖,同时伴随宿主细胞快速分裂。【结论】中华蜜蜂幼虫原代细胞培养基在含15%FBS的Grace中能够良好生长,并且CSBV可以在该原代细胞中进行复制。

乳腺癌原代细胞培养及体外药敏试验的应用研究

目的 :通过乳腺癌体外原代细胞培养 ,对乳腺癌近年常用的化疗药物进行敏感性检测 ,探讨乳腺癌在不同化疗药物之间的敏感性差异 ,以期指导临床化疗。方法 :通过体外肿瘤细胞药敏试验即MTT法实验对 82例乳腺癌新鲜标本进行体外肿瘤细胞原代培养及化疗药物的敏感性检测 ,并将其化疗药物的敏感性结果进行比较。结果 :无论是单药组间比较 ,还是联合药物组间比较 ,其敏感性均无差异 (P >0 0 5 )。乳腺癌对各单药的敏感性分别与对其相应的联合药物的敏感性比较 ,敏感性均有显著差异 (P <0 0 1)。其中 ,以 5 FU加MMC和 5 FU加MTX的敏感性为好 ,敏感率分别为 78 0 5 %、79 2 7%。结论 :体外肿瘤细胞原代培养及化疗药物的敏感性检测对临床肿瘤化疗用药有很强的预见性 ,且能发现耐药病例 ;对乳腺癌患者进行化疗时 ,应尽量选择联合用药方案。

人胃癌原代细胞培养方法的探讨

目的探讨一种经济、易行的人胃癌原代细胞培养的方法。方法培养瓶瓶底用鼠尾胶原包被,放置经过处理的1mm×1mm×1mm大小的人胃癌组织块数个,加入适量培养液使组织块底部刚好没入液体内,24小时换液一次,至大量肿瘤细胞培养出来。结果肿瘤细胞在2天￣3天后从组织块内爬出,呈半贴壁生长,并开始大量生长,蔓延至整个瓶底。结论利用经济易行的方法对人胃癌新鲜标本进行原代细胞培养,可以得到存活的肿瘤细胞。

猪骨骼肌原代细胞培养方法的优化

猪骨骼肌细胞的原代培养在研究猪骨骼肌的发育和调控机制中发挥重要的作用。试验通过对不同的胰酶消化时间(10min,30min,60min)、离心转速(800r/min,1 000r/min,1 500r/min)以及首次换液时间(24h,36h,48h)分别进行比较和分析,培养适宜时间后观察细胞的形态、个数及贴壁成活率,筛选最佳的培养体系。试验结果显示在37℃下浓度为0.25%的胰酶消化30min,1 000r/min下离心5min,37℃恒温培养箱培养36h后对细胞进行首次换液,细胞贴壁状态和成活率最佳。研究结果为猪原代骨骼肌细胞的培养筛选了最佳的培养体系,并为猪骨骼肌生长发育机制的相关研究提供重要工具。

常规培养条件下成年大鼠颈动脉体原代细胞培养

目的 探讨成年大鼠离体颈动脉体的细胞培养方法.方法 选取8~9周龄健康成年雄性SD大鼠,体重250~270 g,游离双侧颈总动脉分叉,体视显微镜下分离出完整颈动脉体,置于100μl胶原酶缓冲液中,采用酶加机械切割方法消化细胞,离心后通过常规培养基重悬细胞后种于预先包被多聚-D-赖氨酸的玻片上.借助颈动脉体Ⅰ型细胞标志物酪氨酸羟化酶和Ⅱ型细胞标志物胶质纤维酸性蛋白鉴定所培养细胞,并通过巢蛋白染色鉴定有无干细胞特性.结果 常规培养基可以培养出有活性的成年8周龄大鼠的颈动脉体原代细胞,Ⅰ型细胞可以保持类似于体内生长状态的簇状,Ⅱ型细胞散在分布.在这些原代培养细胞中含有巢蛋白阳性干细胞.结论 常规培养基能够培养出活性较好且符合体内生长特性的成年大鼠颈动脉体细胞,满足后续颈动脉体分子机制的研究.

人子宫平滑肌瘤原代细胞培养方法的建立和优化

子宫肌瘤是一种常见的良性妇科肿瘤,多发生在育龄期女性,与雌激素浓度密切相关^[1-3]。本病发病率高,大多数患者临床症状不明显,一般随着年龄增长,雌孕激素浓度的下降,可自行萎缩,但有部分患者子宫肌瘤过大或者生长过快,症状明显可能出现经血增多及其引起的贫血,过大的子宫肌瘤产生压迫症状如便秘、尿潴留、腰痛,甚至流产。

斑马鱼性腺组织的原代细胞培养技术的建立

[目的]建立斑马鱼卵巢和精巢组织的原代细胞培养技术，获得原代和传代培养细胞单层。[方法]采用组织块贴壁法进行斑马鱼卵巢和精巢组织的原代细胞培养，采用0．25％胰蛋白酶消化法进行传代培养。[结果]斑马鱼性腺组织的原代细胞培养条件为：最适培养基为DMEM／F12（pH 7．0～7．2），培养温度为24℃，在添加20 ng／mL 表皮生长因子（EGF）、20 ngm／L 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、0．5 mmol／L β－巯基乙醇和15％胎牛血清时更有利于细胞的存活。其中，卵巢的组织块接种3～4 d后，上皮样细胞首先开始迁出，迁出的上皮样细胞生长5 d后，逐渐凋亡；此后，成纤维样细胞和另一种上皮样细胞开始大量迁出，10 d后可生长汇合成80％的原代细胞单层；可成功传代培养1次，但传代后的上皮样细胞不贴壁，很快死亡，而传代后的成纤维样细胞可贴壁生长，但基本不分裂，健康存活7 d后开始逐渐凋亡。精巢组织接种5 d后，上皮样细胞和成纤维样细胞同时开始迁出，培养16 d后逐渐凋亡，仅得到60％原代培养细胞单层。[结论]初步建立了斑马鱼性腺组织的原代细胞培养条件，并将卵巢组织块迁出的成纤维样细胞成功传代1次。

杂色鲍原代细胞培养方法的优化及其在基因功能研究中的应用

优化了杂色鲍原代细胞的培养条件,并利用原代细胞进行了RNAi和外源基因表达。结果表明,较高的渗透压对血淋巴细胞培养起重要作用,淋巴细胞分离液分离血淋巴细胞更利于其生长。原代细胞培养至第5天,在细胞培养液中添加50μg My D88 dsRNA,能够显著降低My D88 mRNA的表达。p EGFP-N1转染培养5 d的鳃细胞,5 d后可以检测到绿色荧光。该研究表明可以成功培养杂色鲍血和鳃原代细胞,并且利用原代细胞可以进行功能基因表达量调低或调研究,为功能基因注释提供了便利条件。

大黄鱼性腺原代细胞培养技术的建立

为建立大黄鱼精巢和卵巢组织的原代细胞培养技术,获得单层的性腺原代细胞,采用组织块贴壁法,对来源于大黄鱼的卵巢和精巢组织的细胞进行原代培养,并使用0.25%胰酶消化法尝试传代培养。在26℃条件下,添加20%胎牛血清,在100 IU/mL青霉素(Penicillin)和100μg/mL硫酸链霉素(Streptomycin)的DMEM/F-12(HAM)1∶1培养基中培养大黄鱼卵巢和精巢组织的细胞。结果显示:1)大黄鱼卵巢组织在贴壁后第4天成纤维细胞开始迁出,呈辐射状生长;贴壁后第6天迁移出上皮样细胞,呈“铺石路”状生长;贴壁后第17天左右出现不同程度贴壁抑制。2)大黄鱼精巢组织在贴壁后第5天迁出成纤维细胞;第9~17天,部分成纤维细胞呈长梭形涡旋状生长,部分呈三角形均匀分布增殖;贴壁后第18天左右部分细胞空泡化严重。3)在培养后第8天对卵巢和精巢组织原代细胞进行胰酶消化传代培养,传代培养第2天部分细胞贴壁分裂增殖,传代培养3 d后可进行第二次传代,第二次传代后细胞长势变缓,细胞空泡化加快。

用于基因治疗的大鼠骨骼肌原代细胞培养法及相关指标测定

目的 建立用于基因治疗的体外SD大鼠骨骼肌细胞快速培养方法和抗生素筛选浓度。方法 10只小鼠分 3次采用组织块法和消化法培养骨骼肌细胞 ,进行Actin免疫组化鉴定。用含不同浓度G4 18和潮霉素B的培养液培养观察。结果 组织块法培养速度明显高于消化法 ,传代接种的细胞在 3～ 7d增殖达高峰。G4 18和潮霉素B的最小致死浓度分别为 80 0 μg/ml和 2 0 0 μg/ml。 结论 组织块培养法是骨骼肌细胞简易快捷的培养方法 ,可以在很短的时间里提供充足的细胞。

胃癌与大肠癌原代细胞培养化疗药物敏感性的对比

对消化道肿瘤多药耐药性（MDR）的研究证实，胃癌与大肠癌中多种耐药因子均可高表达，但后者对化疗药物敏感性较差。本研究旨在对比研究胃癌和大肠癌对化疗药物敏感性的差异，以及肿瘤分化程度及耐药相关因子P—gp、GST-π、p53表达对这种变化的影响。

对活检肺癌组织行原代细胞培养及药敏试验的研究

对活检肺癌组织行原代细胞培养及药敏试验的研究熊玮沈寒放材料与方法：（１）组织细胞来源：对４６例经纤维支气管镜（纤支镜）活检肺癌组织进行原代细胞培养，其中鳞癌２８例、腺癌１０例、小细胞癌８例。（２）原代肺癌细胞培养：经纤支镜向支气管腔内注入含庆大霉素的...

刀额新对虾原代淋巴细胞培养及其感染白斑综合征病毒(WSSV)的病理特征

为深入了解对虾白斑综合征病毒(WSSV)的致病机理和体外培养的对虾细胞对WSSV的敏感性,实验以1.5×L-15培养基培养刀额新对虾原代淋巴细胞,待细胞形成单层后接种WSSV,通过倒置显微镜、荧光显微镜、透射电子显微镜观察接种病毒后细胞的病理变化。结果显示,使用1.5×L-15培养基培养对虾淋巴组织,3 h后可观察到有细胞迁出,并能迅速形成单层,36 h后细胞的迁出汇合率可达80%,且能存活20 d以上。接种WSSV 24 h后,出现病变的细胞变圆、漂浮,细胞之间的网状结构消失,最后细胞破碎、溶解;接种WSSV 48 h后Hoechst 33342染色结果显示,感染的细胞核深染,且变形、膨大;电镜下,细胞核内含大量成簇分布的杆状病毒,细胞器被挤向细胞边缘,细胞膜轮廓模糊。研究表明,纯化的病毒粒子接种体外培养的淋巴细胞,能够使其产生明显病理变化,证明了WSSV对体外培养的淋巴细胞具有感染力,并且可在淋巴细胞中增殖。

牙鲆原代肾细胞培养及其对牙鲆弹状病毒的易感性研究

为探索牙鲆弹状病毒(HIRRV)对敏感宿主牙鲆肾脏原代细胞的敏感性,本研究分别采用组织块移植法和胰酶消化法对牙鲆(Paralichthys olivaceus)肾脏细胞进行分离和原代培养。研究显示,采用组织块移植法进行培养后,会出现较多的成纤维样细胞,而采用胰酶消化法进行培养后,细胞呈现上皮细胞样且形态完整,7天后细胞的汇合率可达80%。采用胰酶消化法对牙鲆肾细胞进行原代培养,传代后进行病毒敏感性实验,实验表明牙鲆肾细胞接种HIRRV后,第3天出现了明显的CPE,病毒滴度达1×105.8 TCID50/mL;RT-PCR可从感染3天的细胞培养物中检测到HIRRV的特异性mRNA;利用抗HIRRV单克隆抗体结合免疫荧光试验可从感染24h的细胞中检测到特异性荧光信号,信号分布在细胞膜和细胞质中。研究结果表明,基于胰酶消化法建立的牙鲆肾脏原代细胞对HIRRV较敏感,HIRRV可成功侵染该细胞并在细胞内实现快速增殖。本研究为牙鲆弹状病毒的致病机制研究提供了材料和实验基础。

原代肝细胞培养技术研究现状及其新药研发中的应用

通过查阅近期有关文献,综述了国内外原代肝细胞分离、培养技术研究情况及其药代动力学与毒理学方面的应用。