基于末端脱氧核糖核酸转移酶的纳米界面上DNA的生长策略及用于恩诺沙星的适配体传感器构建研究

在纳米金(Au nanoparticles,AuNPs)表面通过组装巯基DNA制得AuNPs-DNA生物探针后,末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl transferase,TdTase)催化探针DNA的3′-OH 端,实现DNA的生长,并得到生长产物长单链DNA(Single-stranded DNA,ssDNA)。通过琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜成像(Atomic force microscope,AFM)对探针及ssDNA进行表征,结果表明TdTase能够实现纳米界面上DNA的高效生长,卷曲状态下链长可达850 nm。进一步将这种DNA的生长策略与适配体(Aptamer)技术相结合。首先在纳米金表面组装适配体片段1,在醛基化的磁珠颗粒表面组装适配体片段2,以此构建针对恩诺沙星的适配体生物传感器(Aptasensor)。该传感器对ENR在10 ~1.0×10 5 ng/mL具备良好的响应性能,检出限为1.0 ng/mL,能明显区分环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等对照组信号。研究表明,基于TdTase的适配体传感器操作便捷,具备良好的靶分子响应性能和特异性,可为食品安全检测等领域提供新的研究思路。

原位末端转移酶地高辛标记法检测凋亡细胞

采用地高辛原位末端标记法（ＩｎＳｉｔｕＥｎｄＬａｂｅｌｉｎｇ，ＩＳＥＬ），建立了Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ细胞的原位检测体系。结果显示：小鼠胸腺细胞在体外培养８ｈ时，台盼兰拒染率为９４％～９５％，地塞米松刺激的胸腺细胞ＤＮＡ电泳呈典型的“梯形条带（Ｌａｄｄｅｒｐａｔｅｒｎ）”，ＩＳＥＬ标记的细胞阳性率为７４．４％，未经地塞米松刺激和未经培养直接标记的胸腺细胞阳性率分别为２８．６％和１０．２％。

末端转移酶原位标记法检测细胞凋亡

建立一种用末端转移酶标记对凋亡的细胞进行原位检测的方法。方法：在末端转移酶催化下，将地高辛修饰的核苷酸掺入凋亡细胞中的ＤＮＡ断裂缺刻，再用显色法检测被标记的ＤＮＡ，从而检出凋亡细胞。结果：本实验建立了一种灵敏、特异、有效的凋亡检测方法。结论：末端转移酶介导的原位标记法是研究凋亡的一个非常有用的工具。

原位DNA末端转移酶法检测细胞凋亡的影响因素

利用原位ＤＮＡ末端转移酶（ＩＳＴｄＴ）法检测肝硬变、肝癌组织标本及小鼠小肠粘膜上皮细胞凋亡。结果发现２５ｍｇＬ－１蛋白酶Ｋ消化１５ｍｉｎ，ＴｄＴ反应后采用中火档微波处理５ｍｉｎ可获最佳结果。

荧光原位杂交技术检测人类宫颈端粒酶RNA组分基因的表达及其临床意义

目的探讨荧光原位杂交(FISH)技术检测人类宫颈端粒酶RNA组分(hTERC)基因在不同程度宫颈病变中的表达及其临床意义。方法收集133例妇科疾病患者的宫颈脱落细胞及组织,以及20位健康体检妇女的正常宫颈脱落细胞,应用FISH技术检测宫颈脱落细胞以及病变组织中的hTERC基因扩增情况。结果单纯炎症病变、未明确诊断的不典型鳞状细胞(ASCUS)、低度鳞状上皮内病变(LSIL)、高度鳞状上皮内病变(HSIL)及鳞状细胞癌患者宫颈脱落细胞hTERC基因扩增的阳性率分别为0.00%、15.79%、81.82%、95.45%及100.00%;单纯炎症或宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ级、CINⅡ级、CINⅢ级及宫颈浸润癌患者病变组织hTERC基因扩增的阳性率分别为3.45%、52.38%、71.43%及100.00%。宫颈癌患者宫颈脱落细胞及病变组织hTERC基因的表达与CIN的差异有统计学意义(P<0.05)。结论 hTERC基因扩增可预测宫颈病变的发展趋势。

荧光原位杂交检测宫颈上皮脱落细胞人端粒酶基因表达与人乳头瘤病毒的临床应用

目的研究宫颈癌人端粒酶基因(TERC)的表达情况和宫颈癌人乳头瘤病毒(HPV)感染的相关性,评估荧光原位杂交(FISH)技术检测TERC基因的表达对子宫颈上皮内瘤样病变(CIN)发展到宫颈癌的预测价值。方法采用FISH技术进行子宫颈上皮脱落细胞TERC基因的检测,实验对象81例,病理正常组20例,CIN1组28例,CIN2组12例,CIN3组9例,宫颈癌组12例。同时利用实时荧光定量聚合酶链反应技术(FQPCR)检测这81例病人的HPV(16/18)感染情况。并进行宫颈癌与TERC基因和HPV的相关性分析。结果在不同病理分组中TERC基因检测和HPV检测的阳性率差异有统计学意义(P<0.05),TERC基因检测的阳性率在不同病理分组中的差异有统计学意义(P<0.05),HPV的阳性率在不同病理分组中的差异也有统计学意义(P<0.05),恶性程度越高差异越显著(P<0.01);宫颈癌组TERC基因异常表达阳性率是100%,HPV为91.7%。结论 TERC基因异常表达与宫颈癌的发生发展及HPV感染密切相关。TERC基因和HPV联合检测,有助于提高宫颈癌的早期诊断有重要价值。

骨巨细胞瘤组织中端粒酶活性的原位检测及意义

目的 :探讨骨巨细胞瘤 (GCT)石蜡切片中端粒酶活性检测的可行性以及端粒酶在GCT生物学特性中的意义。方法 :采用针对人端粒酶hTERT寡核苷酸探针序列 ,对 2 7例GCT石蜡标本进行原位杂交 ,检测端粒酶逆转录酶 (hTERT)mRNA的表达情况。结果 :2 7例GCT中 8例hTERTmRNA表达阳性 ,石蜡切片中基质细胞、部分多核巨细胞hTERTmRNA表达阳性。结论 :采用原位杂交技术检测GCT石蜡切片中hTERT表达 。

一个新的人类乙酰转移酶基因hNATL的克隆与表达谱研究

从小鼠cDNA序列入手,依据同源分析的电子克隆方法得到一个包含N末端乙酰转移酶结构域的人类新基因hNATL(Human NAT Like)。hNATL的cDNA长1803bp,编码区621bp,Genbank 登陆号AY632082。hNATL编码的蛋白长206个氨基酸残基,包含有N乙酰转移酶结构域。hNATL 基因定位于人染色体17q25．2区,包括6个外显子和5个内含子。基因表达汇编分析结果显示, hNATL在人脑和生殖腺中高表达。Northern杂交显示,在成年小鼠中hNATL在心脏,脾脏和卵巢中出现表达。整体原位杂交的结果显示,hNATL特异表达于E7．5和E8．5的小鼠胚胎脑部和HH10期鸡胚胎的头部。上述结果提示,hNATL对胚胎期脑的发育和成体中重要器官行使正常功能发挥十分重要的作用。

大肠癌中端粒酶RNA的表达及意义

目的 :探讨端粒酶RNA(hTR)表达在大肠癌发生、发展中的意义以及与细胞增殖的关系。方法 :应用原位杂交方法检测 2 6例大肠癌、18例大肠腺瘤、18例大肠息肉及 5例炎症病变中端粒酶hTR的表达。应用免疫组化EnVision法检测Ki 67抗原的表达 ,反映细胞增殖活性。结果 :2 6例大肠癌hTR以强阳性表达为主 (2 1/2 6 ,80 8% ) ;18例大肠腺瘤hTR大部分呈弱阳性表达 (12 /18,66 7% ) ,少数呈强阳性 (5 /18,2 7 8% ) ;息肉、炎症hTR为弱表达。端粒酶hTR表达在大肠良、恶性病变中存在差异 (P <0 0 1) ,并且随肿瘤分化程度的下降、浸润深度的增加以及淋巴结转移的发生 ,hTR表达增强 (P <0 0 5 )。此外 ,在细胞增殖活跃区域 ,显示出高水平hTR的表达。结论 :在大肠肿瘤发生早期就有端粒酶hTR表达的上调 ,而且hTR表达与肿瘤分化程度、浸润和转移等呈正相关。hTR表达也与细胞增殖活性相关。用原位杂交方法检测端粒酶hTR的表达 。

端粒酶在良恶性胸水中的表达及临床意义

目的探讨端粒酶在良恶性胸腔积液中的表达及其与良恶性胸腔积液临床表现的关系。方法利用荧光原位杂交方法对23例恶性胸腔积液和25例良性胸腔积液的端粒酶活性进行检测,并结合临床资料分析。结果23例恶性胸水中,端粒酶表达阳性19例(82.6%),而25例良性胸水中,端粒酶表达阳性2例(8.0%),二者比较有统计学差异(P<0.05);早期恶性胸腔积液和晚期恶性胸腔积液的端粒酶表达阳性率分别为81.8%和83.3%,二者比较无统计学差异(P>0.05)。结论端粒酶阳性表达与恶性胸腔积液的发生有关,是一个重要的肿瘤标记物,在恶性胸水脱落细胞中检测到端粒酶表达可作为早期病变的辅助指标。

人类染色体端粒酶RNA基因在高危型人乳头瘤病毒阳性宫颈脱落细胞中的应用

目的探讨宫颈脱落细胞中人类染色体端粒酶RNA基因(hTERC)在高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染的宫颈病变中的表达。方法对210例HR-HPV阳性者中细胞学检查正常组30例、宫颈不典型鳞状上皮细胞(ASCUS)50例、低度鳞状上皮内病变(LISL)50例、高度鳞状上皮内病变(HISL)50例、鳞状细胞癌(SCC)30例患者的宫颈脱落细胞中的hTERC行荧光原位杂交技术检测,应用受试者工作特征曲线(ROC曲线)确立宫颈HISL(CINⅡ、CINⅢ、SCC)的最佳界值。结果①在正常组、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、SCC组hTERC的阳性表达率分别是2.7%、11.3%、81.0%、96.0%、100%,其中CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、SCC组与正常组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);CINⅠ与CINⅡ、Ⅲ组及SCC组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。随着宫颈病变程度的增加,各组中hTERC基因的扩增阳性率有增加的趋势(P<0.05),且个体阳性细胞核的计数增加,分别为正常组2.0%,CINⅠ组6.4%、CINⅡ组9.6%、CINⅢ组11.0%、SCC组20.0%,各组间的差异均有统计学意义(P<0.05)。②hTERC检测HR-HPV阳性中高(度)鳞状上皮内病变及宫颈的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度分别94.01%、89.25%、91.67%、92.22%、91.90%。③多种复合类型的信号模式在HISL中的表达较高。结论 hTERC在预测HR-HPV阳性且宫颈细胞学检查为异常的宫颈病变的病理结果中具有重要的意义。个体hTERC阳性细胞个数及信号模式构成有望成为辅助宫颈病变筛查及监测病变进展的重要分子生物学指标之一。

端粒酶蛋白催化亚单位基因及其蛋白在胃癌中的表达

目的 探讨端粒酶蛋白催化亚单位 (hTERT)基因mRNA及其蛋白在胃癌发生、发展中的重要作用以及在胃癌诊断中的意义。方法 应用原位杂交方法检测 5 3例胃癌标本中hTERTmRNA的表达 ,应用免疫组化S P法检测相同标本中hTERT蛋白的表达。结果 5 3例胃癌标本中 ,hTERTmRNA阳性 41例 (77% ) ,其中低分化腺癌阳性 18例 (82 % ) ,高分化腺癌阳性 2 1例 (81% ) ,黏液腺癌及黏液细胞癌阳性 2例 (2 / 5 ) ;hTERT蛋白阳性共 46例 (87% ) ,其中低分化腺癌阳性 2 0例 (91% ) ,高分化腺癌阳性 2 5例(96 % ) ,黏液腺癌及黏液细胞癌阳性 1例 (1/ 5 ) ;hTERTmR NA及hTERT蛋白的表达在低分化腺癌组与高分化腺癌组之间差异未见显著性 (P >0 0 5 ) ,但hTERTmRNA与hTERT蛋白之间呈正相关 (rS=0 6 2 3,P <0 0 1)。

细胞凋亡原位检测的TUNEL法

细胞凋亡原位检测的ＴＵＮＥＬ法刘勇（江西省人民医院病理科，南昌３３０００６）细胞凋亡（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ），又称程序性细胞死亡（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｄｅａｔｈ，ＰＣＤ），是细胞的一种生理性死亡过程，有关细胞凋亡的研究近年来受到高度重视。末端转移...

免疫双标记细胞的检测在中枢神经系统白血病诊断中的意义

目的 :观察末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT)及淋巴细胞系列相关抗原双标记细胞在脑脊液中的检出对中枢神经系统白血病 (CNS L)的临床意义。方法 :采用免疫荧光标记技术配合流式细胞术 ,检测初治或完全缓解期急性淋巴细胞白血病脑脊液中TdT及淋巴系列相关抗原双标记细胞及其治疗后的变化。结果 :6 4例中 8例脑脊液检出上述免疫双标记细胞 ,均为急性淋巴细胞白血病 ,其中 1例无CNS L临床迹象 ,免疫双标记细胞占3.38% ,经治疗后免疫双标记细胞在脑脊液均明显减少或消失。结论 :脑脊液中免疫双标记细胞的检出对CNS L的诊断及治疗指导具有重要的临床意义 。

应用荧光原位杂交技术在组织标本中检测宫颈上皮病变的端粒酶RNA基因扩增

目的 用荧光原位杂交（FISH）技术检测端粒酶RNA基因（TERC）在宫颈上皮内瘤变（CIN）和宫颈鳞状细胞癌（scc）组织中的扩增，探讨其用于SCC筛查及CIN诊断的可行性及实际意义。方法选取手术切除及活检的子宫颈组织标本196例，有效样本150例，采用FISH技术在石蜡包埋组织芯片上检测TERC基因的扩增情况。结果150例组织芯片样本中，正常宫颈鳞状上皮24例，CIN78例（CINI级25例，Ⅱ级21例，Ⅲ级32例），SCC48例。正常宫颈鳞状上皮组织中TERC基因无扩增，从CINI级到SCC组织中，TERC基因的扩增率依次为8．0％（2／25）、47．6％（10／21）、71．9％（23／32）和87．5％（42／48），差异有统计学意义（P〈0．05）。组问两两比较：正常宫颈鳞状上皮与CINⅡ级、Ⅲ级、SCC组，组间比较差异均有统计学意义（P〈0．05）；CINⅠ级与C1NⅡ级、Ⅲ级及SCC组组问比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；CINⅡ级组与SCC组相比，差异有统计学意义（P〈0．05）。正常宫颈鳞状上皮与CINⅠ级组、CINⅡ级与Ⅲ级组、CINⅢ级与SCC组，组问差异均无统计学意义（P〉0．05）。高度癌前病变（CINⅡ～Ⅲ级）与低度癌前病变（CINⅠ级）的TERC基因扩增结果：25例CINⅠ级病变中，2例扩增，23例不扩增；53例CINⅡ—Ⅲ级病变中，33例扩增，20例不扩增。经公式计算，敏感性为62．3％、特异性为92．0％、准确度为71．8％、阳性预测值为94．3％、阴性预测值为53．5％。结论在石蜡包埋CIN及SCC组织切片上应用FISH技术进行TERC基因检测，方法可行，结果可靠；可作为辅助CINⅡ级的诊断；TERC基因扩增可以预测CIN发展为癌的风险，具有一定的实用价值。

FISH检测宫颈脱落细胞hTERC基因的表达及其临床意义

目的:探讨宫颈上皮内瘤变(CIN)患者人类染色体末端酶(hTERC)基因的表达和临床意义。方法:收集2006年10月至2007年6月北京大学人民医院妇科122例宫颈脱落细胞标本,其中CIN患者66例、宫颈鳞癌(SCC)患者20例、正常细胞学妇女36例,用荧光原位杂交(FISH)方法检测脱落细胞hTERC基因。结果:在CINⅠ、CINⅡ/Ⅲ和SCC患者宫颈脱落细胞中hTERC基因的表达率分别是16.13%、48.57%和90%,CINⅠ、CINⅡ/Ⅲ、SCC组与正常组比较,hTERC基因阳性率差异有显著统计学意义(P<0.001),其中,CINⅠ与CINⅡ/Ⅲ、CINⅠ与SCC比较,CINⅡ/Ⅲ与SCC比较差异有统计学意义(P<0.05)。随着病变程度增加,hTERC基因表达率增加。hTERC基因检测CINⅡ/Ⅲ的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别是48.57%、92.53%、77.27%和77.5%。CIN和SCC组hTERC基因拷贝数明显增加,其中CIN患者平均拷贝数为2.8,SCC组平均拷贝数为3.2,hTERC基因的表达水平与宫颈病变的程度关系密切。结论:hTERC基因在CIN和SCC中表达异常,且随病变程度增加阳性表达率增加,可作为宫颈癌前病变进展的生物遗传学监测指标。