原位细胞凋亡检测技术体会

目的 探讨TUNEL法检测细胞凋亡的最佳条件。方法 各取 2 0例大肠癌组织和鼠脑组织 ,分成A、B两组 ,A组按照宝灵曼公司推荐的条件操作 ,B组按照本实验室改进后的条件操作。结果 A组与B组细胞凋亡阳性率无区别 (P >0 .0 5 ) ,A组背景着色明显高于B组 (P <0 .0 1)。

TUNEL法检测大鼠死后心肌细胞核DNA断裂与死亡时间关系研究

目的用原位脱氧糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）观察大鼠死后心肌细胞DNA断裂与死亡时间（postmortem interval，PMI）的关系。方法建立SD大鼠死亡模型，在25.1℃，分别于死后6、12、24、36、48、60h提取大鼠心肌组织进行TUNEL检测，显微成像系统采集图像，经计算机图像系统分析及统计学处理。结果死后6—60h，心肌细胞核荧光染色依次由绿色、黄绿色亮度增强、亮黄色到荧光亮度减弱；形态由扁圆形或柱状，大小较均匀，到体积增大、呈毛虫状、多数核碎裂到形态不规整，大部分核形成碎片；心肌组织细胞核的IG，死后6h至36h依次增高，36h达到高峰，随后下降；心肌细胞核DNA的AG死后24h最高。结论死后各时间点，心肌细胞核的荧光颜色和亮度以及细胞核的大小和形态有一定的变化规律。

甲状腺癌中细胞凋亡指数的检测及其意义

目的检测细胞凋亡指数(Apoptosis Index,AI)在甲状腺癌中的表达,探讨细胞凋亡在甲状腺癌发生中的作用。方法应用原位细胞凋亡检测(TUNEL)试剂盒对36例甲状腺癌及6例结节性甲状腺肿组织进行AI的检测。结果结节性甲状腺肿的细胞AI平均值为12.39±2.21,甲状腺癌组织的细胞AI平均值为20.17±2.68,二者差异具有显著性(P<0.05)。AI与病人的年龄、病理分型、临床分期和淋巴结转移无关,P>0.05。结论甲状腺癌组织的AI平均值高于正常对照组,肿瘤细胞凋亡的失衡在甲状腺癌发生中起作用。

寻常型天疱疮与大疱性类天疱疮皮损原位细胞凋亡研究

目的 :探讨角质形成细胞凋亡在寻常型天疱疮 (PV)和大疱性类天疱疮 (BP)皮损发生发展中的作用。方法 :采用原位细胞凋亡检测 (TUNEL)方法研究两病患者皮损角质形成细胞的凋亡情况。结果 :(1)性别、年龄、病程、疗后评分、住院天数、激素总量等对天疱疮的凋亡指数影响无统计学意义 (P均 >0 0 5 ) ;但天疱疮的疗前评分高者 ,凋亡指数较高 (P <0 0 1) ;(2 )性别、年龄、病程、疗前评分、疗后评分、住院天数、激素总量等全部分析因素对类天疱的凋亡指数影响均无统计学意义 (P均 >0 0 5 ) ;(3 )正常对照 8例表皮细胞凋亡指数均 <0 0 0 5 ,天疱疮与类天疱疮凋亡指数均明显高于对照组 (P均 <0 0 1) ;(4 )角质形成细胞凋亡发生部位 :PV ,疱内分离的及疱周围的棘层、基底层细胞 ;BP ,水疱上方及附近的棘层、基底层细胞。结论

吸烟对牙龈上皮细胞凋亡的影响

目的:观察不同程度吸烟患者的牙龈上皮棘层和基底层细胞凋亡的情况,评价吸烟对牙龈上皮细胞正常代谢和蛋白质分泌的影响。方法:选取47例具有不同吸烟史、无严重系统疾病且行牙冠延长术或智牙拔除术的患者为研究对象,男41例,女6例,年龄18～29岁(平均年龄21.4岁),根据吸烟史、日平均吸烟支数和总吸烟支数,将患者分为Ⅰ(轻)度(吸烟史<5a,或2≤日均支数<10且总支数约1.5万支以下)19例,Ⅱ(重)度(5a≤吸烟史,或10≤日均支数且总支数约1.5万支以上)28例。另取无吸烟史的10例患者作为对照组。采用原位末端标记(TdT-mediated-dUTPnickendlabeling,TUNEL)法检测牙龈上皮棘层和基底层细胞的凋亡情况。采用Newman-Keuls法比较各吸烟组之间及其与对照组间的差异,取α=0.05水准。结果:吸烟者的牙龈上皮棘层和基底层细胞凋亡阳性的表达高于未吸烟者,且棘层(P<0.01)改变较基底层(P<0.05)明显。轻度吸烟组和重度吸烟组之间也存在显著性差异(P<0.05、P<0.01)。结论:吸烟对牙龈上皮棘层的凋亡具有明显的促进作用,从而干预上皮细胞的正常蛋白分泌和代谢。

仙鹿活骨丸对激素性股骨头坏死细胞凋亡影响的实验研究

目的从微观结构变化考察仙鹿活骨丸对激素性股骨头坏死细胞凋亡影响,为临床应用提供参考。方法给大鼠臀肌注射醋酸强的松龙造成激素型股骨头坏死模型,通过原位细胞凋亡检测、光镜和电镜考察仙鹿活骨丸对激素性股骨头坏死细胞凋亡影响。结果原位细胞凋亡检测分析,发现模型大鼠给仙鹿活骨丸后细胞凋亡数量明显减少;光镜观察可以发现,仙鹿活骨丸可以减少空缺骨陷窝数,降低股骨头组织坏死程度。电镜观察可以发现,仙鹿活骨丸治疗后的骨细胞细胞核染色质和染色体相对均匀,线粒体、高尔基体、内质网等细胞器增多,而糖原溶解与脂肪空泡均较模型对照组减少,因而可提高成骨细胞骨形成的功能,有助于股骨头缺血性坏死修复过程。结论仙鹿活骨丸可以减少激素性股骨头坏死细胞凋亡,改善坏死部位的组织形态学,治疗股骨头坏死。

Cloning and Expression Analysis of the High Mobility B Group Genes in Arabidopsis thaliana

[Objective] The aim was to better research the function and action mode of High Mobility Group B （HMGB） proteins in higher plants. [Method] At2G33450,At5G23405 and At5G23420 genes of HMGB protein family in Arabidopsis thaliana were cloned by the use of RT-PCR method,and the expression of these three proteins in E.coli and Arabidopsis thaliana were detected by using SDS-PAGE,Northern blot and subcellular localization methods. [Result] The results showed that the molecular weights of the three proteins were 17.5,17.0 and 27.0 kD respectively,and the expression levels of the proteins in Arabidopsis thaliana were At5G23420At5G23405At2G33450. In addition,all the three proteins were located in nucleus. [Conclusion] The study will provide a basis for the further research on the biological function of HMGB proteins in higher plants.

核转录因子-κB在膀胱癌中作用机制的初步研究

膀胱移行细胞癌石蜡包埋标本54例,正常对照标本13例。采用免疫组织化学SP法检测NF-κBP65和PKC蛋白在54例膀胱癌中的表达情况,运用TUNEL法原位检测凋亡细胞。分析NF-κB与PKC、细胞凋亡之间的关系,探讨NF-κB在膀胱癌中的可能作用机制。结果表明,NF-κBP65和PKC蛋白在54例膀胱癌标本中阳性表达率分别为:88.9%、81.5%,显著高于正常膀胱标本(P<0.01);54例膀胱癌中细胞凋亡的发生率为88.9%,凋亡指数均数为29.5741,均高于正常膀胱组织(P<0.01);NF-κBP65蛋白的表达与PKC蛋白的表达呈正相关(r=0.506,P<0.01),与细胞凋亡呈负相关(r=-0.390,P<0.01)。因此推论,NF-κB可能被PKC激活后,通过某种途径抑制细胞调亡,促进膀胱癌的发生和发展。

吸烟者和正常牙龈上皮细胞凋亡的对比研究

目的对比吸烟者和未吸烟者的牙龈上皮细胞凋亡的情况不同，评价吸烟对牙龈上皮细胞凋亡的影响并探讨其可能机制。方法选择21例行冠延长术的男性患者，年龄为30～45岁，无相关系统疾病和明显的牙龈疾病。无吸烟史10人作对照，切取的牙龈上皮经新鲜配置4％多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋，TUNEL（TdT．mediated—dUTP nick end labeling，TUNEL）法原位细胞凋亡检测牙龈上皮的细胞凋亡情况。Newman—Keuls法计算各吸烟组与对照组及各吸烟组之间的差异，取α=0．05水准。SP免疫组化法对凋亡抑制基因Bcl-2的表达进行组织定位。结果各吸烟组与对照组都存在显著差异（P〈0．01）；轻度吸烟组和重度吸烟组间也存在显著性差异（P〈0．01）。Bcl-2在吸烟者的牙龈上皮的表达较对照组减弱。结论吸烟促进牙龈上皮细胞凋亡的发生，干扰牙龈上皮的正常代谢。

不同吸烟程度对牙龈上皮凋亡抑制蛋白表达的影响

目的观察不同程度吸烟患者的凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达情况。方法选择37名行牙龈切除、拔除智齿及牙冠延长术的患者,年龄21～65岁,男34例,女3例。按照吸烟史分为Ⅰ组(吸烟史<6年,日均支数<11支)17例,Ⅱ组(吸烟史≥6年,日均支数≥11支)20例。选7例健康牙龈作为对照组。牙龈标本制作石蜡切片,行组织学观察。采用SP免疫组化法对凋亡抑制基因Bcl-2的表达进行组织定位。石蜡切片脱蜡、水化至水,按照SP免疫组化说明书步骤操作,常规脱水封片后行组织学观察。Bcl-2的阳性表达呈棕黄色,阴性为蓝色。PBS作阴性对照。结果 Bcl-2阳性表达主要分布在颗粒层和棘层,胞质呈棕黄或褐色,越接近基底层表达越强。吸烟组Bcl-2的在颗粒层和棘层的阳性表达细胞数较对照组减少且着色变浅,基底层细胞则都为阴性表达。凋亡阳性表达的细胞胞核呈棕黄褐色。对照组较吸烟组阳性表达弱,胞核着色轻。对照棘层和基底层的细胞凋亡阳性表达率分别为0.431和0.672,低于各吸烟组的平均水平。吸烟组牙龈上皮基底层及棘层细胞的阳性表达与对照组间具有显著性差异(P<0.05);吸烟Ⅰ组与吸烟Ⅱ组也存在显著性差异(P<0.05)。结论吸烟可导致牙龈Bcl-2基因的表达降低。

急性一氧化碳中毒迟发性脑病大鼠模型的建立

目的探讨建立适合实验研究需要的急性一氧化碳中毒迟发性脑病大鼠模型。方法 64只雄性SD大鼠,随机分成空气对照组(AC组)和模型组(CO组),每组32只。采用静态吸入式染毒,选取染毒后3、7、14、28d为时相点,应用Morris水迷宫实验检测平均潜伏期等学习记忆能力,Tunel法检测海马回神经元凋亡。结果 CO组大鼠较AC组平均潜伏期延长(F=35.93,P<0.01),海马回神经元凋亡指数增高(P<0.01)。结论本实验成功建立了可行性较高的急性一氧化碳中毒迟发性脑病大鼠模型,为进一步研究其发病机制和防治方法提供比较好的基础。

惊厥持续状态幼年大鼠海马CHOP水平的动态变化及依达拉奉对其表达的影响

目的观察惊厥持续状态(SC)幼年大鼠海马前凋亡因子CHOP动态表达及神经细胞凋亡的变化,探讨依达拉奉(ED)对二者的影响。方法将195只SD幼年雄性大鼠随机分为9 g.L-1盐水对照组(NS组)、SC组和ED组,每组65只,各组均按SC后处死时间点分为2 h、12 h、24 h、48 h、72 h 5个亚组,每组13只。应用氯化锂-毛果芸香碱建立大鼠SC模型,用半定量反转录-PCR(RT-PCR)动态观察SC后大鼠海马CHOP mRNA的表达,采用免疫组织化学SABC法检测海马CA1区CHOP蛋白表达;并用HE染色观察海马CA1区病理改变,原位细胞凋亡检测法(TUNEL)观察海马CA1区神经元凋亡细胞数。结果 1.RT-PCR法:SC组幼年大鼠海马CHOP mRNA表达于2 h开始增加,于12 h达高峰,之后开始下降;与NS组各时间点比较差异均有统计学意义(Pa<0.01);与SC组比较,ED组(2 h,12 h,48 h)CHOP mRNA表达均明显下降(Pa<0.05,0.01)。2.免疫组织化学结果:SC组幼年大鼠海马CHOP蛋白表达于2 h开始增加,12 h明显增加,24 h达高峰;与NS组各时间点比较差异均有统计学意义(Pa<0.01);ED组各时间点均较SC组明显降低(Pa<0.01,0.05)。3.TUNEL结果:SC组海马CA1区TUNEL阳性细胞数于惊厥后24 h迅速增加,48 h达高峰(Pa<0.05,0.01);与NS组比较,12～72 h时间点组均明显高于NS组(Pa<0.01);与SC组比较,ED组12～72 h CA1区TUNEL阳性细胞数明显减少(P<0.05,0.01)。4.HE染色:SC后出现神经元变性及丢失,48 h组病理改变最显著,与TUNEL表达一致;而ED组病理改变减轻。结论 SC后早期幼年大鼠可能触发了内质网应激中CHOP介导的凋亡信号途径,从而引起了脑损伤;而ED可能通过下调其表达,从而缓解惊厥后脑损伤。