原位聚合酶链反应及其在眼科的应用

原位ＰＣＲ是一种能在组织细胞原位对目的基因进行扩增，用原位杂交技术进行定性、定量和定位研究的技术。它是ＰＣＲ和原位杂交结合的产物，具有高度敏感性、特异性，并能在细胞形态学上准确定位的特点。

结合流式细胞仪检测技术的菌体原位PCR扩增

建立一套原位PCR检测方法 ,联合流式细胞仪作为检测工具 ,作为基因水平转移研究中的基因监控手段。通过常规PCR反应以确定靶基因的基本扩增参数 ;细菌菌体经过多聚甲醛PBS液固定和溶菌酶处理后进行原位PCR扩增 ,产物洗涤后迅速用流式细胞仪进行荧光检测 ,并辅以荧光显微镜镜检。扩增样品在荧光显微镜的蓝光激发下发出明亮的黄绿色荧光 ,与空白对照中的无扩增菌体的自发荧光可明显区分。流式细胞仪检测结果也显示 ,阴性菌与阳性菌的荧光强度有明显区别。完成了对目标细菌的原位PCR扩增 ,并成功地应用流式细胞仪对原位PCR扩增菌体实施了检测。由此表明isPCR

应用原位逆转录PCR技术检测石蜡切片中HCVRNA

利用原位逆转录聚合酶链式反应（ＩＳＲｔＰＣＲ）技术检测了１５例肝细胞癌及其癌旁肝组织中丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ的定位及分布，并探讨影响实验结果的重要因素。结果表明ＨＣＶＲＮＡ阳性信号主要位于肝细胞和癌细胞胞浆，胞核几乎阴性。影响结果的主要因素包括所用蛋白酶Ｋ浓度，消化切片的时间。

直接逆转录原位PCR检测实验性汉坦病毒感染乳鼠脑组织中病毒RNA及其与原位分子杂交的比较

出生后２～３ｄ的昆明种乳鼠，经腹腔接种１００个半数致死量的陈株汉坦病毒，每只０．０５ｍｌ，于接种后１、２、４、６、８、１０、１２、１４ｄ处死动物，每个时间点３～６只不等，取其脑组织固定于４％的多聚甲醛中，石蜡包埋制备５μｍ的连续组织切片，每时间点取１～２例组织切片，用逆转录原位ＰＣＲ（ＲＴ－ＩＳＰＣＲ）方法检测组织中病毒Ｓ片段ＲＮＡ，组织脱蜡后，经ＤＮａｓｅ、蛋白酶Ｋ、消化等予处理，用汉坦病毒ＲＮＡＳ片段特异的一对引物，在组织切片上进行病毒ＲＮＡ的逆转录和ＰＣＲ过程，直接将ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－１１－ｄＵＴＰ掺入到扩增产物中，经过３０个ＰＣＲ循环后，用碱性磷酸酶标记的抗ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ抗体免疫组化检测扩增产物，连续组织切片用ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记的汉坦病毒Ｍ片段Ｇ２编码区ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物的和Ｓ片段特异性探针进行原位分子杂交并与ＲＴ－ＩＳＰＣＲ结果进行比较，另外应用免疫组化检测该基因表达产物病毒核抗原（ＮＰ），结果，ＲＴ－ＩＳＰＣＲ在病毒感染１ｄ的乳鼠脑组织中检测到病毒ＲＮＡ扩增产物，扩增产物定位于神经细胞胞浆内，而原位分子杂交和免疫组化检测阴性。在病毒感染２ｄ及２ｄ以后的乳鼠脑组织中ＲＴ－Ｉ?

厌氧颗粒污泥中微生物种群变化的分子生物学解析

荧光定量-聚合酶链式反应(RTQ-PCR)与荧光原位杂交(FISH)技术对厌氧反应器内不同状态下颗粒污泥中微生物种群的数量变化与空间分布进行研究.结果发现,颗粒污泥中真细菌明显多于古细菌,但随着厌氧反应器有机负荷的提高,古细菌明显增加,其中产甲烷丝菌也明显增加;真细菌多分布生长在颗粒污泥的外层,而对环境条件敏感的古细菌多分布生长在内层,且随着反应器有机负荷的提高,这种层状分布的特点更为明显.

分子生物技术在污水处理系统内硝化菌群研究中的应用

不依赖于纯培养的分子生物技术已广泛应用于环境微生物的研究.综述了近年来在荧光原位杂交技术(Fluorescent in situ hybridization,FISH)和聚合酶链式反应技术(Polymerasechainreaction,PCR)基础上发展起来的几种新分子生物技术的基本原理,包括FISH-MAR、FISH-microelectrodes、Clone-FISH、SIP、PCR-DGGE-cloning-sequencing、PCR-T-RFLP、Real-time fluorescent quantitative PCR和RT-PCR,以及其在污水生物处理系统内硝化菌群研究领域中的应用现状.通过这些分子生物技术,可以识别污水生物处理系统内的硝化菌群;建立硝化菌群动态变化与工艺运行参数之间的相关关系;从微生物学角度对系统运行状态给予最直接、最可靠的分析与证明,为污水生物处理系统的长期稳定运行奠定理论基础.最后对该领域的未来发展进行了展望.

水稻叶片中水通道蛋白基因OsAQP的表达分析

利用半定量RT-PCR技术,检测了水稻水通道蛋白基因OsAQP在水稻不同生长时期叶片中的表达情况。并利用地高辛标记原位杂交技术,检测了OsAQP在叶组织中的定位。OsAQP在叶片中的表达水平在水稻种子发芽后15d内呈现下降的趋势。该基因的转录本在叶片保卫细胞中的信号最强,叶肉细胞中信号较弱,而在表皮细胞中没有检测到信号,提示该基因可能通过介导保卫细胞水分的快速运输而与气孔功能相关。

大鼠酒精性肝病细胞凋亡与细胞色素P4502E1和氧化应激的关系

目的:观察大鼠酒精性肝病组织病理形态学改变,探讨细胞凋亡与细胞色素P4502E1的表达以及和氧化应激的关系.方法:用酒精灌胃法制备酒精性肝病大鼠模型,模型组给予酒精8 g/kg,每天分2次灌胃连续8 wk,对照组给予等量的生理盐水灌胃.实验8 wk末,观察肝组织的病理形态学改变,用原位末端标记法(TUNEL)检测肝细胞凋亡,用免疫组化法检测肝组织中Caspase-3蛋白表达,用全自动生化仪检测ALT和AST的含量,用PCR法测定肝细胞色素P4502E1的基因表达,分别用硫代巴比妥酸法(TBA法)和黄嘌呤氧化酶法测定肝组织丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活力.结果:模型组凋亡的肝细胞明显增多,主要分布在中央静脉周围、点状和灶状坏死区;Caspase-3主要分布于中央静脉及肝细胞坏死灶周围细胞的胞质中.模型组肝细胞凋亡指数(AI)和Caspase-3蛋白表达强度明显高于对照组(AI:6.2%±1.7% vs 1.7%±0.8%;Caspase-3:66.7% vs 9.5%,P<0.05,P<0.01).CYP2E1表达:对照组c1基因频率为91.6%,c2基因频率为8.4%;模型组c1基因频率为53.4%,c2基因频率为46.6%,均有显著性差异(P<0.05).长期酒精摄入大鼠血清MDA含量增加(41.53±7.43μmol/L vs 15.72±2.06μmol/L,P<0.05),SOD活力下降(353.12±61.02 kU/L vs 636.82±138.60 kU/L,P<0.05),与酒精性肝病肝细胞凋亡程度有相关性(r=0.644,r=-0.511).结论:长期酒精摄入可引起大鼠酒精性肝病及及肝功能损伤,肝细胞凋亡明显增加.CYP2E1基因PstⅠ及RsaⅠRFLPs与酒精性肝病有关,其中c2基因可能与大鼠酒精性肝病的发生有关.MDA含量和SOD活力在酒精性肝病的肝细胞凋亡过程及脂质过氧化反应中发挥重要作用.

鼻NK/T细胞淋巴瘤的免疫表型、EBV感染及TCRγ基因重排的检测

目的检测鼻NK/T细胞淋巴瘤(NK/TCL)的免疫表型、EBV感染及TCRγ基因重排,为诊断和鉴别诊断提供依据。方法收集诊断鼻NK/TCL48例患者石蜡包埋标本,用免疫组化SP法标记LCA、CD79α、CD20、CD56、CD3、CD45RO及EBV抗体研究其免疫表型;EBER探针原位杂交方法检测EBV编码的小分子RNA(EBER);聚合酶链式反应扩增方法检测TCRγ基因重排。结果48例鼻NK/TCL均表达LCA,CD3、CD45RO、CD56和EBV阳性率分别为44%、52%、73%和19%,CD79α和CD20均阴性;EBER阳性率为81%;TCRγ基因重排阳性率为19%。结论鼻NK/TCL免疫表型不一致,并非所有病例CD56阳性,石蜡切片中CD3阳性定位于细胞质;EBER在肿瘤细胞中高表达,提示它们可能为NK细胞来源;部分TCRγ基因重排阳性病例应为鼻NK样T细胞淋巴瘤。

侵袭性真菌感染分子病理诊断进展

组织病理学是诊断侵袭性真菌感染的金标准之一,但由于病原真菌在组织学中形态的相似性以及混合感染的存在,难以将病原真菌鉴定到属或种水平。分子病理诊断方法如聚合酶链式反应(PCR)、基于激光捕获显微切割的LCM-PCR及荧光原位杂交(FISH)对福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织中病原真菌具有高效、快速、高特异性的诊断价值。该文主要针对分子病理技术在侵袭性真菌感染领域的研究进展进行综述。

胎盘滋养层细胞的感染和凋亡与HBV的宫内传播机制

目的:通过HBV感染体外培养的人绒毛膜滋养层细胞,探讨HBV宫内感染发生的机制.方法:对人早孕绒毛膜滋养层细胞进行原代培养和对人滋养层细胞系JEG-3进行传代培养,将HBV感染血清与原代及传代培养细胞共同孵育8-48h,倒置显微镜观察细胞形态及细胞间连接,细胞免疫荧光和免疫组织化学染色方法检测滋养层细胞中HBsAg和HBcAg的表达,荧光定量PCR方法检测被感染的滋养层细胞中的HBV DNA,TUNEL方法检测滋养层细胞的凋亡.结果:与HBV阳性血清共同孵育对滋养层细胞的形态和细胞间连接无明显影响;细胞免疫荧光和免疫组织化学染色结果显示,滋养层细胞与HBV感染血清共同孵育(8,24,48h)后,滋养层细胞可以出现HBsAg和HBcAg的阳性表达,24 h时HBsAg阳性细胞数量最多(8h:18.0%±3.67%;24h:30.6%±2.88%;48 h:24.8%±4.21%);荧光定量PCR方法检测到被感染的滋养层细胞中HBV DNA的存在;TUNEL结果显示,与HBV感染血清共同孵育可导致滋养层凋亡细胞数量逐渐增加(24h:18.6%±3.05%;48h:26.8%±2.86%:P<0.01).结论:滋养层细胞的感染可能是HBV通过胎盘屏障的途径之一;HBV感染可以诱导滋养层细胞产生凋亡,这可能是胎盘屏障阻止HBV宫内感染的一种保护性机制.

雌激素受体GPR30在大鼠下颌下腺组织中的定位、核心片段克隆及序列分析

目的探讨雌激素受体G蛋白耦联受体30(GPR30)在大鼠下颌下腺组织中的表达,为进一步研究此受体对下颌下腺的功能调节提供理论依据。方法取SD大鼠4只,腹腔麻醉后切取下颌下腺,采用免疫组织化学和原位杂交方法进行定位研究;从下颌下腺组织中分别提取总RNA,应用RT-PCR方法获得GPR30基因的cDNA核心序列,并进行序列分析。结果大鼠下颌下腺浆液性腺泡及颗粒曲管上皮细胞呈GPR30免疫反应阳性,阳性物质分布于细胞质和细胞膜上,细胞核呈阴性反应。上述细胞同样含有GPR30mRNA杂交信号,信号物质亦分布于细胞质内,细胞核呈阴性反应。经序列分析发现,从大鼠下颌下腺组织中扩增出GPR30基因的特异性条带。结论大鼠下颌下腺浆液性腺泡上皮细胞能够表达雌激素受体GPR30,说明其可能是雌激素快速作用的靶器官。

NK/T细胞淋巴瘤的免疫表型、EB病毒感染及TCRγ基因重排的检测

目的检测NK/T细胞淋巴瘤(NK/TCL)的免疫表型、EB病毒感染及TCRγ基因重排,为诊断和鉴别诊断提供依据。方法收集诊断NK/TCL48例患者石蜡包埋标本,用免疫组化S-P法标记LCA、CD79α、CD20、CD56、CD3、CD45RO及EBV抗体研究其免疫表型;EBER探针原位杂交方法检测EB病毒编码的小分子RNA(EBER);聚合酶链式反应扩增方法检测TCRγ基因重排。结果48例NK/TCL均表达LCA,CD3、CD45RO、CD56和EBV阳性率分别为44%、52%、73%和19%,CD79α和CD20均为阴性;EBER阳性率为81%;TCRγ基因重排阳性率为19%。结论NK/T细胞淋巴瘤免疫表型不一致,并非所有病例CD56阳性,石蜡切片中CD3阳性定位于细胞质;EBER在肿瘤细胞中高表达,提示它们可能为NK细胞来源;TCRγ基因重排阳性说明NK/TCL中存在T细胞的单克隆性增生。

急性白血病微小残留病检测方法临床应用的研究进展

急性白血病(AL)患者治疗后微小残留病(MRD)水平直接决定AL复发和患者的生存期。近年来,越来越多的方法用于MRD的检测,如荧光原位杂交(FISH)、聚合酶链式反应(PCR)技术、流式细胞术(FCM)、质谱技术,其预测疾病复发、评估预后等临床价值得到广泛认可,可为AL的临床干预治疗提供依据。

RET融合基因在鼻咽癌中的检测

目的筛查RET融合基因在鼻咽癌组织和细胞系中的表达情况。方法利用组织芯片通过荧光原位杂交(FISH)和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测137例鼻咽癌组织和6株常见鼻咽癌细胞系中RET融合基因的表达情况。结果在鼻咽癌组织和细胞系中均未发现RET基因出现断裂融合,同时在细胞系中亦未发现KIF5B/RET基因的表达。结论鼻咽癌中未发现RET融合基因的表达,RET基因在鼻咽癌发生、发展中并未起主导作用,或许不能作为治疗鼻咽癌的靶点,因此需要进行鼻咽癌全基因组分析。

简单、快速、高效扩增和标记目的基因技术的研究

从固体平板挑取转化带有目的基因的单菌落 ,用特异引物通过聚合酶链式反应可直接扩增和标记目的基因 ,不需经过菌的液体培养、质粒提取和酶解反应等复杂过程 ,能快速获得目的基因扩增产物和进行目的基因探针的标记。

内皮素受体基因表达与肝硬化门脉高压症内脏血流动力学的关系

目的 探讨肝硬化患者肝组织中内皮素受体 (ETAR及ETBR)mRNA的表达及其与内脏血流动力学的关系。方法 肝硬化组 (n =15例 ) ,组织学检查证实为肝硬化 ;对照组为肝外伤病人 (n =10例 ) ,组织学检查证实为正常肝组织。采用原位杂交及RT PCR技术检测肝组织中ETAR及ETBRmRNA的表达 ,同时测定门静脉压力(Pp)、门脉血流量 (Qp)、平均动脉压 (MAP)和心率 (HR)。 结果 肝硬化患者肝组织中ETAR及ETBRmRNA的表达均显著高于外伤肝组织 ,ETAR及ETBRmRNA的表达与Pp呈直接相关 ,ETBRmRNA的表达与Qp呈直接相关。结论 ETAR及ETBRmRNA的表达与门脉高压症的严重程度直接相关 。

轻链限制性浆样细胞在增生生发中心的临床病理分析

在日常病理诊断工作中,出现滤泡增生(follicular hyperplasias,FHs)伴生发中心出现轻链限制性浆样/浆细胞(light chain-restricted plasmacytoid/plasma cells within germinal centers,LCRGCs),在一定程度上增加了误诊的可能性。作者通过免疫组化、原位分子杂交以及聚合酶链式反应的方法,对17例FHs伴LCRGCs病例进行研究发现:即使生发中心出现BCL-2阳性并且检测出单克隆性,FHs伴LCRGCs通常也与淋巴瘤的发展无关。

猪圆环病毒的分子生物学研究进展

圆环病毒(circovirus)是近几年引起广泛重视的新的病毒,它可以感染植物、动物和人.猪圆环病毒(porcine circovirus)主要引起猪的一种多系统功能障碍性疾病,临床上以新生仔猪先天性震颤(congenital tremors CT)和断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome PMWS)为表现形式,由于圆环病毒的感染,破坏了机体的免疫系统,临床上常呈并发或继发感染猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome PRRS)、细小病毒(porcine parvovirus PP)、猪流感(swine influenza virus SIV)、猪瘟(hog cholera HC)、伪狂犬(pseudorabies PR)、皮炎肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome PDNS)等,从而对世界养猪业造成了巨大的损失.

BCR-ABL融合基因检测方法的进展

BCR-ABL融合基因可编码产生BCR-ABL融合蛋白,是慢性粒细胞白血病的特征性标志,对慢性粒细胞白血病的诊断、治疗具有重要意义。目前临床有多种方法可对其进行检测,主要有细胞遗传学、荧光原位杂交、聚合酶链式反应、Western Blot印迹法、流式免疫磁珠(CBA)等检测方法。这些检测方法有的费时费力,有的需要专门的实验设备等,故在临床应用中受限。随着对BCR-ABL融合基因检测技术的发展,CBA法对BCR-ABL融合蛋白的检测具有其特有的优越性而得到越来越多的应用。