微滴式数字PCR在检测胃腺癌和结直肠腺癌NTRK基因融合中的应用

目的评估微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)应用于NTRK基因融合检测的可行性。方法回顾性分析830例原发性结直肠腺癌和560例胃腺癌样本,分别运用免疫组织化学(IHC)和荧光原位杂交(FISH)技术检测石蜡包埋肿瘤组织中pan-TRK蛋白表达情况以及NTRK1/2/3基因断裂情况。FISH及IHC阳性样本进一步行二代测序(NGS)检测及ddPCR检测。结果所有石蜡包埋肿瘤样本均成功进行IHC和FISH检测。FISH或IHC阳性样本合计26例,其中FISH阳性21例,IHC阳性18例。26例阳性样本进一步行RNA Seq NGS、DNA Seq NGS及ddPCR检测。DNA Seq NGS合计检测到14例NTRK基因融合,2例扩增。RNA Seq NGS合计检测到3例NTRK基因融合,ddPCR检测结果与RNA Seq NGS完全一致。结论ddPCR可有效区分FISH和DNA Seq NGS检测为NTRK非典型融合的结直肠腺癌和胃腺癌病例,可以作为除FISH之外NTRK基因初筛方法的补充。

结合流式细胞仪检测技术的菌体原位PCR扩增

建立一套原位PCR检测方法 ,联合流式细胞仪作为检测工具 ,作为基因水平转移研究中的基因监控手段。通过常规PCR反应以确定靶基因的基本扩增参数 ;细菌菌体经过多聚甲醛PBS液固定和溶菌酶处理后进行原位PCR扩增 ,产物洗涤后迅速用流式细胞仪进行荧光检测 ,并辅以荧光显微镜镜检。扩增样品在荧光显微镜的蓝光激发下发出明亮的黄绿色荧光 ,与空白对照中的无扩增菌体的自发荧光可明显区分。流式细胞仪检测结果也显示 ,阴性菌与阳性菌的荧光强度有明显区别。完成了对目标细菌的原位PCR扩增 ,并成功地应用流式细胞仪对原位PCR扩增菌体实施了检测。由此表明isPCR

原位PCR和原位杂交检测蛋鸡J亚群禽白血病病毒

根据ALV_J原型株HPRS10 3株gp85基因的内部序列 ,和pol基因的 3′端设计一对引物H5 H7。从发生ML病死蛋用型鸡的肿瘤、骨髓、肝脏、脾脏和输卵管组织中提取总RNA ,反转录为cDNA ,经PCR扩增得到长度为 5 4 5bp的ALV_JcDNA特异性探针。探针定位于 5 2 5 8～ 5 80 2bp。将病鸡的组织石蜡切片置HybaidExpress原位PCR仪平台上 ,以H5 H7为引物进行原位PCR扩增。应用地高辛标记的cDNA探针对原位PCR扩增后切片进行了原位杂交检测。结果在待检组织肿瘤组织、十二指肠、骨髓中出现明显的阳性信号。睾丸、肺、胰腺、大脑、输卵管、肾脏均检出散在的阳性信号。这是国内外首次从分子水平证明蛋鸡J亚群禽白血病。

检测石蜡切片中鸭病毒性肠炎病毒间接原位PCR方法的建立

【目的】建立能对石蜡切片中鸭病毒性肠炎病毒(DEV)核酸进行定位的原位PCR方法,为鸭病毒性肠炎(DVE)存档蜡块的回顾性诊断、致病机理研究等提供有效的实验手段。【方法】据DEV的UL30-UL31基因序列设计PCR引物和寡核苷酸探针,以DEV感染死亡鸭肝脏组织石蜡标本制作切片,经蛋白酶K消化、原位PCR扩增和生物素标记的寡核苷酸探针原位杂交,建立了检测石蜡标本中DEV的间接原位PCR方法并应用于人工感染DEV不同时间的鸭肝脏、DVE发病鸭的存档蜡块和临床病料检测。【结果】间接原位PCR对DVE死亡鸭肝脏的石蜡标本检测结果为阳性,而鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌病、鸭多杀性巴氏杆菌病、鸭沙门氏菌病和鸭大肠杆菌病死亡鸭肝脏的石蜡标本检测结果为阴性;间接原位PCR对人工感染DEV后2、4、6、12、24、48和72 h不同时间的鸭肝脏检测结果均为阳性,阳性细胞有肝细胞、窦皮细胞和枯否氏细胞,阳性信号多出现于坏死细胞的碎片中或细胞坏死后形成的空泡内及空泡边缘;对存档蜡块、临床病料的检测与病毒分离鉴定吻合率为100%。【结论】本研究建立的间接原位PCR方法具有直观、敏感、特异性强的优点,在显示核酸阳性信号的同时,还能判别含有靶序列的细胞类型以及组织细胞的形态结构特征与病理变化。可用于DVE的诊断、分子流行病学调查、存档蜡块的回顾性诊断和致病机理的研究。

梨组织中苹果褪绿叶斑病毒的原位RT-PCR检测

为了建立梨树苹果褪绿叶斑病毒原位RT-PCR检测技术，用已知带有苹果褪绿叶斑病毒的库尔勒香梨和无病毒实生苗叶片为材料，利用DIG标记，研究了香梨病毒的叶片石蜡切片IS-RT-PCR检测技术。包括AMV逆转录酶、dNTPs、RNasin及互补引物浓度对cDNA合成的影响，退火温度、TaqDNA聚合酶、Mg^2＋、引物浓度及循环次数对原位PCR效果的影响。结果表明：RNasin的用量大于0．2U·μL^-1时，信号强度随着RNasin量的加大而增强；只有当dNTPs浓度达1．0mmol·L^-1时才能生成一定量的cDNA；AMV浓度在0．3-0．5U·μL^-1均可进行正常的逆转录，而且在该范围内产物的量随AMV浓度提高而增多；引物浓度达到0．9μmol·L^-1以上时才能进行有效的逆转录，并且生成的cDNA的量随引物浓度增大而增加。原位扩增ACLSV的cDNA适合退火温度为56℃。循环20-30次可出现较强的蓝色信号，引物浓度在0．8-1．2μmol·L^-1时显色较好；Taq酶浓度为20U·μL^-1以上，均显示较深的蓝色；Mg^2＋浓度为1．5mmol·L^-1就可满足原位PCR所需。获得了苹果褪绿叶斑病毒的原位PCR优化检测体系，利用建立的优化程序对香梨样品进行了检测验证，取得了很好效果。

巴西橡胶树HbMyb1基因的原位PCR物理定位

为探讨巴西橡胶树（Heveabrasiliensis）皮病抗性相关HbMyb]基因的定位，采用所建立的橡胶树染色体原位PCR技术体系进行研究。结果表明，HbMybl基因初步定位于巴西橡胶树‘热研7．33—97’的第5号染色体长臂上，信号位点到着丝粒的百分距离为15．21，并观察到在巴西橡胶树‘热研7．33．97’叶片细胞核的不同分裂时期均扩增到1～2个信号。同时对染色体标本的制备、保存、预处理等方面进行了探讨。

利用直接原位PCR法探讨柯萨奇B3病毒与心肌炎的病原学关系

目的 探讨柯萨奇 B3病毒 (CVB3 )感染与急性心肌炎的病原学关系。方法 应用生物素标记的核苷酸直接掺入法 ,建立了直接法原位逆转录 -聚合酶链式反应 (RT-PCR)技术 ,分别对感染的 He L a细胞、病毒性心肌炎鼠心肌样本及临床心肌炎的心肌活检标本中的 CVB3进行检测。结果 病毒感染的 He L a细胞可见阳性信号 ,细胞呈蓝紫色 ,而未感染的 He L a细胞无阳性信号 ,细胞不着色。在 CVB3感染的病毒性心肌炎小鼠心肌组织中可检测到病毒 RNA的存在。 16例病理学及临床诊断为心肌炎的患者心肌组织中 ,7例检测到 CVB3 RNA,而 16例正常心肌标本中均为阴性。结论

适合原位RT-PCR的石蜡切片制作方法

石蜡切片是原位RT-PCR中常用一种生物制片技术,简要阐述原位RT-PCR的原理以及适合于原位RT-PCR的石蜡切片的制作流程,对其易出现的问题和解决办法作了简要的概述。

应用原位PCR对鸡传染性法氏囊病病毒早期侵染过程的研究

人工接种 35日龄SPF鸡传染性法氏囊病病毒 ,间隔不同时间采集法氏囊、胸腺、脾、盲肠扁桃体、肾、肝和腿肌进行了原位PCR检测 ,同时观察各组织病理变化。结果无论是H毒株还是Ts毒株 ,接种后 4h肝、肾、脾等组织中即出现明显的阳性信号 ,Ts毒株 4hPI从胸腺、盲肠扁桃体、腿肌等组织中也检出了病毒基因序列。接种H毒株和Ts毒株后 2 8h和 40h ,法氏囊淋巴细胞开始出现变性、坏死。在阳性信号检出的时间上 ,法氏囊较肝、肾、脾等组织是滞后的。H毒株较Ts毒株在早期对法氏囊具有更强的侵染能力。

半套式原位 PCR 技术在非何杰金氏淋巴瘤 bc1-2/JH 融合基因检测中的应用

本文在实验中建立了半套式原位ＰＣＲ技术，采用一对半引物，两次ＰＣＲ扩增，经外引物扩增的片段又经内引物扩增，既增加了反应的特异性，又增加了敏感性，并能得到丰富的特异性靶序列。对于组织切片中低拷贝基因的检测更赋有意义。

豫医无毛小鼠无毛基因DNA原位PCR检测

目的 :探讨原位PCR技术对检测基因组变异的有效性。方法 :应用原位PCR检测豫医无毛小鼠皮肤和脾的石蜡组织切片 ,并以健康昆明小鼠皮肤和脾的石蜡组织切片、PCR反应液不加TaqDNA聚合酶、不加引物和引物不带生物素作为对照。结果 :豫医无毛小鼠皮肤和脾石蜡组织切片中检测到清晰的杂交信号 ,而且杂交信号位于细胞核内 ;4组对照均未出现杂交信号。结论 :原位PCR在基因组变异检测方面实用。

猫肾F_(81)传代细胞中犬细小病毒原位PCR检测方法

目的 建立在猫肾F81 细胞中犬细小病毒原位PCR的检测方法。方法 在猫肾F81 细胞上感染犬细小病毒 ,设计特异性引物 ,用直接原位PCR法在染毒 12h ,2 4h ,48h细胞片上检测出犬细小病毒 ,并与常规免疫组化的方法进行了比较。结果 在染毒 48h的细胞片上 ,用阳性记分法将两种检测方法得到的阳性细胞进行统计比较 ,差异极显著 (P <0 .0 0 1) ,用原位PCR法所得出的阳性率高。

逆转录PCR及原位杂交检测人IgA肾病肾脏中TGF-β mRNA

为研究转化生长因子－β（ＴＧＦ－β）在ＩｇＡ肾病病理机制中的作用，本文用逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）法及原位杂交法检测ＩｇＡ肾病患者肾活检组织中的ＴＧＦ－βｍＲＮＡ。结果证实：在人正常肾和ＩｇＡ肾病肾组织中均可检测到ＴＧＦ－βｍＲＮＡ的ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物；ＴＧＦ－βｍＲＮＡ原位杂交的阳性信号主要分布于肾小管和集合管上皮细胞内，肾小球内的阳性信号较弱，且强度与系膜的增生程度有关。

原位反转录PCR技术的应用

针对已有资料中对于以DNA为靶基因序列的原位 PCR介绍较多,而对于原位反转录PCR的介绍很少,但在实际研究工作中有很多检测的靶基因是 RNA(病毒的或基因组的 RNA)的实际情况,就原位反转录PCR技术的基本原理、影响试验结果的关键因素和步骤,如组织细胞的固定、引物和探针的选择、蛋白酶及DNA酶消化、假阳性及假阴性的产生等进行了概述,旨在通过探讨上述问题,对该技术的实际应用有所指导。

原位PCR技术检测PTEN基因DNA在肺癌中的表达

目的:从DNA水平检测PTEN基因在肺癌组织中的表达,探讨PTEN基因的表达与肺癌发生发展的关系。方法:应用原位PCR技术检测56例肺癌石蜡标本PTEN基因DNA表达。结果:①PTEN DNA表达阳性信号主要位于癌细胞核,胞浆中亦有少量表达,阳性产物呈棕黄色弥漫分布;②不同性别患者的PTEN基因的表达不同,但差异甚微;③PTEN DNA表达在非小细胞肺癌中的阳性率明显高于小细胞肺癌中的表达阳性率;④分化不良的肺癌PTEN基因表达阳性率低于分化良好和中等分化者;⑤19例有淋巴结转移的肺癌患者PTEN基因表达明显低于37例无淋巴结转移者。结论:PTEN基因在肺癌组织中的表达较正常肺组织中的表达有所降低,说明PTEN基因的低表达可能在肺癌的发生发展过程中起重要作用,且该基因的表达与肺癌患者的性别无显著相关,而与肺癌的病理类型、组织分化程度、临床分期,以及有无淋巴结转移密切相关。

原位PCR防脱片方法的选择及应用

原位ＰＣＲ防脱片方法的选择及应用肖莎朱新生郭琳琅原位ＰＣＲ是ＰＣＲ与原位杂交两种方法的结合，其最大的特点就是将附在载玻片上组织切片内的靶基因原位扩增、原位检测、原位观察。这对于探明靶基因与病变发生发展的关系十分重要。然而原位ＰＣＲ步骤多，时间长，其间...