用原位RT-PCR分子杂交定位检测螨(革螨、恙螨)原代培养细胞内HV-RNA的研究(Ⅱ)

目的 研究革螨、恙螨在传播肾综合征出血热病毒 (Hemorrhagicfeverwithrenalsyndromevirus,HFRSV)中的媒介作用。方法 采用革螨、恙螨饲养繁殖的子代幼虫、若虫和成虫 ,消化后作螨细胞原代培养制螨细胞片 ,用原位RT -PCR分子杂交法检测HV -RNA在螨组织细胞内分布和定位。结果 HV -RNA多分布于螨消化系统的上皮细胞 ,卵巢组织细胞内 ;革螨子 4代、子 3代和恙螨若虫组织细胞内HV阳性颗粒较革螨子 2代、子 1代和恙螨幼虫多且密集。结论 革螨、恙螨作为HFRS的生物学媒介有细胞分子水平的直接证据。

揭秘基因密码—荧光原位杂交分子病理报告解读

生命是一部由基因编写的复杂交响曲,而荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)是揭示这部交响曲内在奥秘的重要工具之一。FISH是一种生物分子分析技术,用于研究细胞和组织中的染色体结构、基因定位和基因表达。该技术通过使用荧光标记的DNA或RNA探针与目标DNA或RNA序列杂交,然后通过荧光显微镜观察杂交信号的位置和数量。FISH技术让人们能够在细胞和组织层面上观察基因、染色体的情况,了解患者病变部位的分子生物学特征,从而为个体化医疗提供支持。但对于许多患者而言,他们并不了解FISH,甚至对为何进行FISH检测存在疑惑。本文将从科普角度解读FISH分子病理报告,以及FISH走入临床工作的意义。

单分子荧光原位杂交(smFISH)技术及应用

单分子荧光原位杂交(single-molecule fluorescence in situ hybridization,smFISH)技术是一种通过用偶联荧光基团的寡核苷酸探针,对固定细胞或组织中单个mRNA分子进行成像的方法。smFISH可对RNA进行定位、定量,以此对目标转录本进行实时研究。sm FISH适用于细胞、组织切片等多种类型生物样本。近年来,多种基于基础smFISH的改进技术被发明,进一步促进了该技术的实际应用。smFISH良好的RNA单分子可视化能力,使得其在发育生物学、神经生物学及肿瘤生物学等基础生物学科中得到了广泛的应用。本文综述了smFISH技术基本原理、smFISH技术的局限性、smFISH衍生技术方法、smFISH在不同生物学科中的应用进展,并对smFISH技术的发展前景做出展望。

用分子原位杂交（GISH）鉴定小麦－簇毛麦双倍体、附加系、代换系和易位系

用生物素标记的簇毛麦（Ｈａｙｎａｌｄｉａｖｉｌｌｏｓａ）染色体组ＤＮＡ（ｔｏｔａｌｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ）作探针，以普通小麦染色体组ＤＮＡ作遮盖（用量１：２００左右），进行有丝分裂中期和减数分裂中期Ｉ染色体的分子原位杂交（ＧＩＳＨ），经抗生物素蛋白－辣根过氧化物酶复合物（ｂｉｏ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）和联苯胺四盐酸（ＤＡＢ）检测显色后，小麦－簇毛麦双倍体、附加系、代换系和易位系中的簇毛麦染色体及染色体片段显棕色，与显浅蓝色的小麦染色体可明显区分。用ＧＩＳＨ不仅可以检测导入小麦中的簇毛麦染色质，而且可以清楚地显示出易位染色体断裂点的确切位置。将ＧＩＳＨ用于减数分裂期染色体配对分析，还可以清晰形象地显示出同源和非同源染色体之间的配对和分离情况。

应用分子原位杂交技术解析小麦-天兰冰草部分双二倍体──远中2号的染色体构成

为分析普通小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ）－天兰冰草（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）部分双二倍体──远中２号（２ｎ＝５４）的染色体构成，用生物素（ｂｉｏｔｉｎ－１６－ｄＵＴＰ）标记天兰冰草染色体组ＤＮＡ作为探针，以普通小麦品种中国春染色体组ＤＮＡ为封闭ＤＮＡ（ｂｌｏｃｋｉｎｇＤＮＡ），与远中２号的有丝分裂中期染色体ＤＮＡ进行了分子原位杂交。证明远中２号除具有普通小麦的２１对染色体外，附加了１对小麦－天兰冰草易位染色体（即天兰冰草染色体片段易位到小麦染色体的两臂端部）、５对天兰冰草染色体。说明小麦－天兰冰草部分双二倍体在形成过程中染色体行为是比较复杂的，不仅可能产生小麦－天兰冰草染色体间易位，而且小麦染色体也可能与天兰冰草染色体的３种染色休组染色体共同参与组建新的染色体组附加到小麦中去。

人乳腺癌HPV感染的超微结构和DNA分子原位杂交研究

目的 :对乳腺癌的HPV感染进行形态学定位研究。方法 :对 4 6例乳腺癌切除标本及 7例良性病变标本进行透射电子显微镜以及HPVDNA分子原位杂交检测。结果 :透射电镜下 ,14例 (30 4 0 % )乳腺癌细胞核内有HPV样病毒颗粒 ,颗粒直径 30～ 5 0nm ,或弥漫散布 ,或聚集成团呈假结晶状排列。颗粒圆形或略不规则 ,含有HPV样颗粒的癌细胞核异型性较明显。7例良性病变细胞核内未见到HPV样颗粒。HPVDNA分子原位杂交显示 ,2 1例 (45 6 5 % )乳腺癌细胞核内HPV31/ 33DNA阳性 ,1例软骨肉瘤样化生性癌细胞核同时有HPV31/ 33及HPV16 / 18阳性 ;1例纤维腺瘤 (14 2 9% )也显示HPV31/ 33DNA阳性 (χ2 =2 74 31,P <0 0 5 )。电镜下 85 %病毒样颗粒阳性病例中可检测到HPVDNA存在 ,两种检测结果符合率达73 91%。结论 :乳腺肿瘤内存在未组装的、裸型病毒样颗粒。

加拿大披碱草×野大麦三倍体杂种染色体的分子原位杂交鉴定

加拿大披碱草与野大麦 2个四倍体多年生禾草杂交产生的属间杂种F1为三倍体 (2n =3x =2 1) ,丢失了与亲本染色体基数相同的 7条染色体。为查明该杂种F1的染色体构成 ,应用基因组分子原位杂交方法 ,将父本(♂ )野大麦基因组 (H1H1H2 H2 )DNA用荧光生物素标记作为探针 ,以母本 (♀ )加拿大披碱草基因组 (SSHCHC)DNA作为封组 ,对杂种F1根尖细胞有丝分裂中期的染色体DNA进行原位杂交。结果表明 :三倍体杂种F12 1条染色体中 ,有 14条出现偏黄色荧光信号 ,来自父本 (♂ )野大麦H1H2 基因组有 7条出现橙红色荧光信号 ,来自母本 (♀ )加拿大披碱草S基因组、加拿大披碱草HC 基因组的 7条染色体丢失。

原位分子杂交检测上海真厉螨与柏氏禽刺螨体内肾综合征出血热病毒的研究

目的：提供革螨传播肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）的分子生物学证据。方法：用上海真厉螨与柏氏禽刺螨叮咬ＨＦＲＳＶ接种乳小鼠，取叮咬后ｄ１０及ｄ１００以上的上海真厉螨与柏氏禽刺螨冰冻切片，用地高辛标记ＨＦＲＳＶｃＤＮＡ核酸探针原位分子杂交检测其体内病毒ＲＮＡ。结果：叮咬野鼠型（７６－１１８株）接种乳小鼠后ｄ１０上海真厉螨检出病毒ＲＮＡ，在细胞浆、细胞核中及核膜上呈细密颗粒状或全浆阳性，见于生殖器官细胞、胃及支囊上皮细胞及脑皮质细胞；叮咬家鼠型（ＵＲ株）病毒接种乳小鼠后ｄ１２螨亦检出病毒ＲＮＡ，病毒的细胞组织分布与野鼠型相同；分别检测野鼠型螨３１只和家鼠型２３只，其中阳性分别为１７只和１０只；叮咬野鼠型病毒接种乳小鼠后ｄ１３２，家鼠型ｄ１０２螨仍能检出病毒ＲＮＡ。柏氏禽刺螨叮咬野鼠型病毒接种乳小鼠ｄ１０，检测螨２０只，其中阳性１２只，病毒ＲＮＡ主要分布于生殖器官细胞内。结论：上海真厉螨与柏氏禽刺螨均可经叮咬获得ＨＦＲＳＶ，上海真厉螨可分别感染野鼠型和家鼠型ＨＦＲＳＶ，野鼠型在螨群体内至少可维持１３２ｄ，家鼠型１０２ｄ，具有贮存两型病毒的作用，是ＨＦＲＳＶ的适宜媒介和贮存宿主，在动物宿主间交叉传播两型ＨＦＲＳＶ中?

原位分子杂交法检测恙螨体内肾综合征出血热病毒核酸的研究

为探讨肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）在恙螨体内的分布和定位，采用原位分子杂交技术检测恙螨体内ＨＦＲＳＶＲＮＡ。结果发现：原位分子杂交技术的检出阳性率较ＩＦＡＴ高；ＨＦＲＳＶ阳性信号颗粒呈弥散分布，多见于恙螨幼虫和若虫的腹部组织细胞内，该部位是恙螨的卵巢细胞、中肠及支囊上皮细胞。前体组织细胞内少见；个别幼虫和若虫的前足和中足细胞内亦可见到ＨＦＲＳＶＲＮＡ阳性信号。在原位分子杂交中，若虫组织细胞内的ＨＦＲＳＶＲＮＡ阳性信号较幼虫密集而且量多。

应用核酸原位分子杂交法检测弓形虫SAG1抗原基因在免疫小鼠体内的表达

PCR扩增RH株弓形虫抗原基因SAG1编码序列 ,构建pcDNA3 -SAG1重组表达质粒。DNA免疫接种小鼠 ,3周后处死动物 ,取注射部位肌肉作冰冻切片 ,用原位分子杂交方法检测弓形虫 pcDNA3 -SAG1重组质粒在免疫小鼠肌肉内的表达。结果PCR扩增出SAG1编码区目的基因 ,片段大小为 10 2 0bp。测序、酶切分析表明构建的 pcDNA3 -SAG1重组表达质粒含有扩增的基因。利用原位分子杂交在免疫接种 pcDNA3-SAG1的小鼠骨骼肌中检测到紫蓝色的阳性杂交信号 ,提示局部肌肉有目的基因mRNA转录的发生。

原位分子杂交图象中银粒的分割方法研究

图象分割是图象处理的一个基本技术。运用一种改进的快速Ｏｔｓｕ阈值分割法，并结合其它处理方法对原位分子杂交图象中的银粒进行分割。实验结果表明，该方法在精度和速度方面有其优势，适合于对原位分子杂交图象中银粒的自动分割。

原位分子杂交研究肾综合征出血热尸检组织中汉坦病毒M和SRNA的分布

本文以核酸原位分子杂交法研究了国内不同地区ＨＦＲＳ尸检病例组织中病毒ＲＮＡ的分布和定位。结果在１９例病例组织中均可检测到病毒ＲＮＡ。陕西及沈阳地区病例，阳性部位主要是各脏器上皮及实质细胞。江西地区病例，病毒ＲＮＡ主要出现于各脏器组织内血管壁及毛细血管内皮细胞。广州一例，病毒ＲＮＡ主要分布于肝脏灶性溶解性坏死区域，肺泡壁和肾间质血管等部位。病毒ＲＮＡ主要定位于细胞胞浆，呈颗粒状或全浆阳性，也出现干部分组织少数细胞胞核中。此外，病毒ＲＮＡ还出现于细胞外液和红细胞表面。结果说明，ＨＦＲＳ病毒具有泛嗜性感染及上皮性组织或血管内皮细胞易感的特点，后者可能取决于不同地区ＨＦＲＳ病例所感染的病毒的血清型或毒株不同，从而引起不同类型ＨＦＲＳ及其病理和发病机理的差异。

丁型病毒性肝炎的原位分子杂交及免疫组化研究

利用原位分子杂交和免疫组化方法对１４２例乙型肝炎活检肝组织进行丁型肝炎病毒ＲＮＡ及其抗原的定位研究。２８／１４２例丁型肝炎病毒标记阳性。其中慢性重症型６例；慢性活动性１７例；慢性持续性５例。慢性活动性乙肝重叠丁型肝炎病毒感染组发生早期肝硬变的比例明显高于无重叠感染组（Ｐ＜０．０５）。２８例丁型肝炎病毒感染肝组织１９例ＨＢｃＡｇ阳性，并以核浆型为主，提示活动性ＨＢＶ复制与ＨＤＶ感染的正相关性，两者相加作用导致肝损害加重并加速发展为肝纤维化。ＨＤＶＲＮＡ在肝细胞内大量蓄积，ＨＤＡｇ在碎屑状坏死边缘肝细胞或气球样变肝细胞内呈浆膜型分布，提示ＨＤＶ直接细胞毒在丁型肝炎发病学中的作用。

原位分子杂交技术的几点体会

非同位素标记探针应用于原位分子杂交,虽取得了很大进展,但因其操作步骤较多,时间较长等因素,仍存在一些问题有待克服。以下介绍我们在实际操作中得到的一点初步体会。 1 减少或避免组织掉片的方法 除非蛋白性防脱片胶外,还需注意以下几点:(1)载玻片一定要干净。

HBV感染者胃十二指肠粘膜HBV DNA地高辛原位分子杂交研究

目的 :探讨 HBV在胃十二指肠粘膜的分布、复制、表达及其意义。方法 :应用地高辛原位分子杂交法检测 6 2例 HBV感染者胃十二指肠粘膜 HBV DNA的分布状态 ,并与血清 HBVM、胃十二指肠粘膜 HBs Ag、 HBc Ag、肝炎病情程度进行相关分析。结果 :6 2例 HBV感染者 ,2 7例 (4 3.5 5 % )胃肠粘膜检出 HBV DNA,检出率与肝炎病情程度、血清 HBs Ag、HBe Ag无明显相关 ,与血清 HBV DNA、胃肠粘膜 HBs Ag、HBc Ag密切相关 ;胃肠粘膜 HBV DNA的表达表现为 4种模式。结论 :HBV DNA可在胃肠组织原位复制 ,其不同的表达模式反映了病毒复制或整合的状态。

原位分子杂交检测HFRSVRNA方法研究

采用非放射性标记物－地高辛碱性磷酸酶标记肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）ｃＤＮＡ制备分子探针，检测ＨＦＲＳＶ在鼠肺、恙螨体内分布定位，并对原位分子杂交的各环节进行探讨。结果表明：鼠肺的吞噬细胞、支气管粘膜上皮细胞、血管内皮细胞等均见有阳性颗粒，在恙螨卵巢细胞、中肠及支囊上皮细胞也存在阳性颗粒；在前处理中，明胶硫酸铬钾与多聚赖氨酸的铺片效果相似；室温２ｈ，４２℃１ｈ，４％多聚甲醛处理冰冻切片，可有效防止脱片，且保持良好的细胞形态结构；探针ＰＣＲ标记法优于随机引物标记法；预杂交液加入ｓｐｅｒｍＤＮＡ和ｙｅａｓｔｔＲＮＡ，不用硫酸萄聚糖，可有效地减少背景染色；４２℃杂交１６ｈ。

原位分子杂交技术一些体会

原位分子杂交技术一些体会贺占国，江泓，张文，郭宏原位分子杂交技术是近几年来发展起来的一项新技术。在基础研究和临床诊断上已开始广泛应用。在临床病理诊断中可为早期诊断、鉴别诊断、判断预后提供重要依据。与免疫组织化学相比，其特异性更强，敏感性更高，已受到病...

地高辛配基标记探针在流行性出血热尸检组织中原位分子杂交技术的应用和探讨

将地高辛配基(Dig)标记的探针应用于流行性出血热(EHF)尸检组织的石蜡切片中,进行原位分子杂交四例。方法要点:(1)采用Dig标记的探针及碱性磷酸酶系统、提高其敏感性;(2)为达到被检核酸的暴露彻底、准确,选择合适的消化酶;(3)选择适当的杂交温度和时间,防止了非特异性背景,并避免了组织脱片。结果表明此方法操作简便、安全、快速、敏感。

利用荧光素原位分子杂交检验水样中嗜肺军团菌的研究

目的：利用针对嗜肺军团菌种特异性16SrRNA和军团菌致病基因-巨噬细胞感染增强因子（mip）序列探针原位分子杂交建立嗜肺军团菌的快速、特异性检验方法。方法：设计特异性针对嗜肺军团菌种特异性16SrRNA和mip探针，采用荧光素标记探针对采自西安市8家宾馆中央空调冷凝水、贮水池水各8份进行原位分子杂交，并且结合细菌分离、生化鉴定技术检验水样中嗜肺军团菌。结果：细菌分离鉴定表明2份冷凝水、5份贮水池水分离到可疑菌落，抗体凝集实验证实嗜肺军团菌血清Ⅰ型3份、Ⅴ、Ⅵ型各1份，2份阴性。实验周期约10～12d；原位分子杂交显示16SrRNA、mip的探针杂交信号成堆分布于原虫细胞内，形如杆菌状，16SrRNA与mip的杂交信号存在完全双标记，但有少数mip的杂交信号不与16SrRNA共存，5株鉴定为嗜肺军团菌Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ型的水样原虫中，经16SrRNA、mip探针杂交均为阳性，对2株非嗜肺军团菌水样原虫进行16SrRNA、mip的杂交结果均为阴性。实验周期约20h。结论：结果表明该方法适用于对存在于原虫内致病性嗜肺军团菌进行检验，是种快速、特异性的致病性嗜肺军团菌检验方法。