响应面分析法优化重组原动蛋白2β诱导条件的研究

原动蛋白2β(PK2β)是近年新发现的一个选择性激活PKR1的蛋白质因子。采用响应面分析法(RSM)研究了利用重组BL21(DE3)表达PK2β的最优诱导条件。结果表明,诱导时机与诱导物浓度对PK2β的表达水平具有显著性影响,但诱导时间不具有显著性影响。试验数据拟合与极值分析表明最优诱导条件为工程菌OD600为0.50时,采用终浓度为0.11 mmol/L的IPTG在37℃诱导培养7.73 h,此时PK2β表达水平可达242.78 mg/L。验证试验结果表明,重组PK2β的表达水平比优化前提高了46%,而IPTG的用量减少了89%,有利于大量制备该蛋白质进行后续功能研究及应用研究。

提高重组原动蛋白2表达水平的优化策略

原动蛋白2(PK2)是近年发现的一个具有多种生物学功能的蛋白质因子。采用Design-Expert 7.0.0软件对重组PK2表达的最优诱导条件进行响应面分析。结果表明,诱导起始时机与诱导物浓度是影响重组PK2表达水平的显著性因子。同时,诱导时间-诱导时机、诱导时机-诱导物浓度之间的相互作用对PK2的表达水平具有显著性影响。试验数据拟合与极值分析表明最优诱导条件为:工程菌OD600为0.60时,采用终浓度为0.62 mmol/L的IPTG在37℃诱导培养2.82 h,此时重组PK2的表达水平为170.73 mg/L。优化后的诱导条件导致重组PK2的表达水平提高了51.1%,而所需IPTG减少38.0%,诱导时间缩短53.0%,有利于大量制备重组PK2进行后续功能研究及应用研究。

乙肝表面抗原对人肝癌系HepG2细胞增殖及I型胶原、α-平滑肌肌动蛋白分泌的影响

目的探讨人肝癌细胞系Hep G2中乙型肝炎病毒表面抗原(HBs Ag)对该细胞增殖及I型胶原(Col I)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)分泌的影响。方法采用含不同浓度HBs Ag的培养基对Hep G2细胞组(A组)、LX-2和Hep G2共培养组(B组)细胞进行培养,CCK-8法观察不同浓度的HBs Ag对两组Hep G2细胞增殖的影响,并设含普通培养基的Hep G2组(C组)和LX-2和Hep G2共培养组(D组)进行比较;ELISA法观察敏感浓度的HBs Ag对各组Hep G2细胞Col I、α-SMA分泌的影响。结果随着HBs Ag浓度的升高,各组Hep G2细胞增殖率呈上升趋势,且浓度5 ng/ml时增殖率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。采用5 ng/ml浓度HBs Ag刺激48 h后,与C组比较,A组细胞上清液中Col I和α-SMA水平明显升高,差异有统计学意义(t=3.419,P=0.005;t=4.388,P=0.001);与D组比较,B组Col I和α-SMA表达水平明显升高,差异有统计学意义(t=3.048,P=0.009;t=3.005,P=0.009)。结论 HBs Ag可以促进人肝癌细胞Hep G2的增殖;Hep G2细胞具有分泌Col I和ɑ-SMA的类似肝星状细胞的特质,HBs Ag可能通过刺激肝癌细胞Hep G2和肝星状细胞LX-2共同促进Col I和ɑ-SMA的分泌而促进肝纤维化、肝硬化和肝癌的进展。

Nrf2过表达对乙醇刺激下肝星状细胞激活与增殖及合成Ⅰ型胶原的影响

目的:探讨核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)过表达对乙醇诱导下大鼠肝星状细胞系HSC-T6激活与增殖及I型胶原mRNA及蛋白表达水平的影响。方法:采用脂质体介导法对HSC-T6进行pEGFP-Nrf2重组质粒及pEGFP-N1空载质粒瞬时转染,将细胞分为正常对照组、乙醇刺激组、乙醇刺激+pEGFP-Nrf2质粒组和乙醇刺激+pEGFP-N1空载质粒组。采用RT-PCR及Western blotting方法对HSC-T6中Nrf2、Ⅰ型胶原及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)mRNA及蛋白表达水平进行检测,采用MTT法对HSC-T6细胞增殖水平进行检测,采用流式细胞术对HSC-T6细胞周期分布进行检测。结果:(1)荧光显微镜下观察显示pEGFP-Nrf2质粒成功转染HSC-T6,转染后48h Nrf2 mRNA及蛋白表达水平较其余组显著升高(P<0.05)。(2)乙醇刺激组与乙醇刺激+pEGFP-N1空载质粒组之间细胞增殖水平、Ⅰ型胶原、α-SMA mRNA及蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),均明显高于正常对照组(P<0.05),细胞周期分布G1期比例下降,S期比例升高(P<0.05),而乙醇刺激+pEGFP-Nrf2质粒组细胞增殖水平及I型胶原、α-SMA mRNA及蛋白表达水平与乙醇刺激组及乙醇刺激+pEGFP-N1空载质粒组相比均显著下降(P<0.05),细胞周期分布G1期比例显著上升,S期比例显著下降(P<0.05),呈G1/S期阻滞。结论:Nrf2过表达可显著抑制乙醇对HSC-T6 Ⅰ型胶原及α-SMA mRNA及蛋白表达的促进作用,使HSC-T6细胞周期发生G1/S期阻滞,抑制乙醇诱导的HSC-T6增殖水平的升高,提示其对乙醇诱导的HSC-T6细胞活化具有负性调控作用。

雌激素对宫腔粘连纤维化进程及叉头框F2表达的影响

目的探讨雌激素对宫腔粘连纤维化进程及叉头框(Fox)F2表达的影响。方法采用0.2%Ⅰ型胶原酶消化-筛网过滤-差时贴壁分离法获取原代人子宫内膜基质细胞(HESCs)并进行鉴定。采用10ng/ml转化生长因子β_1(TGF-β_1)作用于HESCs 48h建立宫腔粘连细胞模型。以0、10–6、10–8、10–10、10–12mol/L雌二醇(E2)作用于模型组48h,采用qPCR及Western blotting检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)及FoxF2的mRNA和蛋白表达。结果免疫细胞化学法检测显示HESCs波形蛋白阳性,角蛋白18阴性。模型组α-SMA、COLⅠ、FoxF2的mRNA和蛋白表达均高于对照组(P<0.05),模型构建成功。qPCR检测结果显示,与模型组相比,10^(–6)、10^(–8)、10^(–10)mol/L E_2组α-SMA、CO LⅠ、FoxF2的mRNA表达除10^(–10)mol/L E_2组COLⅠ表达无差异外,其余各组表达均下降(P<0.05),10^(–12)mol/L E2_组α-SMA及COLⅠmRNA表达上升,但差异无统计学意义(P>0.05),FoxF2 mRNA表达下降(P<0.05)。Western blotting检测结果显示,与模型组相比,10^(–6)、10^(–8)、10^(–10)mol/L E_2组α-SMA、COLⅠ及FoxF2蛋白表达下降(P<0.05),10^(–12)mol/L E_2组α-SMA蛋白表达上升,但差异无统计学意义(P>0.05),COLⅠ及FoxF2蛋白表达下降(P<0.05)。结论 FoxF2在宫腔粘连中的表达增加。雌激素可在一定范围内逆转宫腔粘连的纤维化进程,并抑制FoxF2的表达。

转录因子Ets-1在2型糖尿病肾病中的表达及其意义

目的:观察转录因子Ets-1、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-2组织抑制剂(TIMP-2)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)和Ⅳ型胶原(ColⅣ)在2型糖尿病肾病(DN)中的表达及探讨其意义。方法:糖尿病肾病组25例;轻微病变性肾病(MCD)20例设为对照组。采用免疫组织化学染色,观察各实验组肾组织内Ets-1、MMP-2、TIMP-2、α-SMA、vimentin及ColⅣ的表达,并行免疫双染共定位分析。结果:25例DN患者中,男15例,女10例;年龄35～67岁。对照组20例MCD患者中,男12例,女8例;年龄18～46岁。与对照组相比,DN组肾小球内Ets-1表达显著性增加(P<0.05),肾小管间质纤维化区域内Ets-1表达亦明显增加(P<0.05);DN组MMP-2在肾小球及肾小管间质内的表达显著性增加(P<0.05);TIMP-2在肾小球及肾小管间质内的表达也明显增加(P<0.05),肾小球及肾小管间质内MMP-2/TIMP-2比值却显著性降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,DN组肾小球内α-SMA、vimentin及ColⅣ表达明显增加(P<0.05),肾小管间质内α-SMA及ColⅣ表达亦明显增加(P<0.05),vimentin在肾小管间质内表达则显著性增加(P<0.01)。免疫双染显示,2型DN肾组织内大多数Ets-1阳性细胞同时出现MMP-2阳性表达,而α-SMA阳性细胞同时具有ColⅣ阳性表达。结论:Ets-1转录因子可能通过调节MMP-2/TIMP-2系统平衡,影响ECM沉积,在2型DN基质重塑过程中起关键性作用。

系膜细胞缺氧损伤后抗增殖蛋白、转化生长因子-β_1、α-平滑肌肌动蛋白表达变化

目的观察系膜细胞(MCs)缺氧损伤后抗增殖蛋白(PHB)、转化生长因子-β_1(TGF-β_1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化。方法将体外培养的大鼠MCs随机分为模型组和正常组。正常组在常规条件下培养,不做任何处理;模型组置于缺氧小室中(充缺氧气体950 m L/L N2和50 m L/L CO2)密封48 h建立MCs缺氧损伤模型。RT-PCR法检测两组PHB1、PHB2、TGF-β_1、α-SMA mRNA,Western blotting法检测PHB1、PHB2、TGF-β_1、α-SMA、Ⅳ型胶原(COL-Ⅳ)蛋白。结果模型组PHB1、PHB2、TGF-β_1、α-SMA mRNA相对表达量分别为0.56±0.04、0.51±0.06、1.45±0.11、7.39±1.72,正常组分别为1.0±0.00、1.0±0.00、1.0±0.00、1.0±0.00,两组比较,P均<0.05。模型组PHB1、PHB2、TGF-β_1、α-SMA、COL-Ⅳ蛋白相对表达量分别为0.47±0.04、0.25±0.02、1.12±0.06、1.35±0.12、0.89±0.07,正常组分别为0.91±0.04、0.56±0.07、0.75±0.05、0.79±0.09、0.52±0.03,两组比较,P均<0.05。模型组PHB1蛋白与TGF-β_1、α-SMA、COL-Ⅳ蛋白表达均呈负相关(r=-0.924、-0.871、-0.840,P均<0.05),PHB2蛋白与TGF-β_1、α-SMA、COL-Ⅳ蛋白表达均呈负相关(r=-0.928、-0.901、-0.821,P均<0.05)。结论系膜细胞缺氧损伤后PHB表达降低,TGF-β_1、α-SMA表达升高,PHB1表达与TGF-β_1、α-SMA表达均呈负相关。

皮层蛋白和Arp2/3蛋白复合物在文昌鱼原肠期胚胎表达图式的分析

脊椎动物胚胎发育过程中,经卵裂和囊胚期积累了一定数量的细胞后,在原肠期开始出现明显的细胞运动,囊胚表层的细胞通过一个称为组织者(Spemann and Mongald’sorganizer)的结构进入胚胎的内部,经过内陷、内卷、汇聚、延伸等一系列细胞运动,按照既定的方向迁移到达目的地,参与构建各个胚层,这一过程称为形态发生运动。形态发生运动是脊椎动物胚胎发育必不可少的重要步骤,在这一过程中,特定的单个细胞或成群细胞的定向迁移,对于三个胚层(外胚层、中胚层、内胚层),以及由这些胚层所产生的特定组织器官的发育与分化,具有决定性影响。

转化生长因子β2对人晶状体上皮细胞转分化、细胞外基质合成和结缔组织生长因子表达的影响

目的探讨转化生长因子β2（TGF—β2）对体外培养的人晶状体上皮细胞（HLEC）转分化、细胞外基质（ECM）合成及结缔组织生长因子（CTGF）表达的影响。方法实验研究。采用不同浓度TGF—β2（0．0、0．1、1．0、10．0μg/L）对体外培养的HLEC诱导24h，倒置显微镜下观察细胞形态的变化；免疫荧光法检测CTGF、间质转分化标志性蛋白d一平滑肌肌动蛋白（d—SMA）在细胞中的表达时实PCR和Western—blot方法检测CTGF、α-SMA、细胞外基质主要成分I型胶原纤维（COL—I）和纤维连接蛋白（Fn）的表达。结果正常HLEC为多角形贴壁细胞，用不同浓度TGF—α诱导24h后，细胞南单层多角形变为长梭形，细胞间隙变大，呈纤维细胞样改变。TGF—β2可诱导HLEC表达CTGF，并且随浓度的增加，CTGF蛋白（0．53±0．03、0．73±0．01、0．65±0．03）和mRNA（1．00±0．00、7．18±0．41、12．88±0．45、32．84±1．61）表达均增强，差异有统计学意义（F=77．55，P〈0．05；F=379．0，P〈0．05）。TGF—B，能诱导HLEC转分化，浓度依赖性地促进OL—SMA蛋白（0．48-_4-_0．01、0．78±0．04、0．69±0．04）和mRNA（1．00±0．00、2．30±0．22、3．104-0．21、3．86±0．10）的表达，差异有统计学意义（F=62．73，P〈0．05；F=80．22，P〈0．05）。不同浓度（0．0、0．1、1．0、10．0μg／L）TGF—p2从基因和蛋白水平促进HLEC表达COL—I和Fn，COL—ImRNA的相对值分别为1．00±0．00、5．52±0．96、18．31±1．20、82．51±1．45，FnmRNA的相对值分别为1．00±0．00、2．36±0．25、3．27±0．24、4．25±0．24；COL—I蛋白表达相对值分别为0．78±0．05、1．15±0．11、2．16±0．14，Fn蛋白表达相对值为0．64±0．01、0．95±0．02、1．23±0．14，其作用呈浓度依赖性（F=1880．52，105．30，P〈0．05；F=64．44，51．81，P〈0．05）。结论TGF—B，可以诱导HLEC表达CTGF，促进HLEC转分化及细胞外基质的合成。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂对转化生长因子β1诱导体外血管外膜成纤维细胞表型的改变

背景:近年来的研究表明,血管外膜成纤维细胞在血管损伤后新生内膜的增生中起重要作用,但对于引起血管外膜成纤维细胞表型转化的机制尚不十分清楚。目的:观察过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptor,PPAR)γ激动剂对转化生长因子β1诱导体外血管外膜成纤维细胞表型改变,同时检测对Ⅰ胶原蛋白表达的作用。设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2007-07/2008-10在上海交通大学医学院附属第九人民医院组织工程实验室完成。材料:鼠龄2个月的健康雄性SD大鼠,体质量约120g,用于体外培养大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞;转化生长因子β1由美国GenWay Biotech公司提供;罗格列酮粉剂为北京高盟化工有限公司产品。方法:实验分为3组:转化生长因子β1诱导组:以不同质量浓度的转化生长因子β1(3,5,10,15μg/L)诱导成纤维细胞48h;罗格列酮干预组:用不同浓度的PPAR-γ激动剂罗格列酮(5,10,30,50μmol/L)干预成纤维细胞45min后,加入转化生长因子β110μg/L共同培养48h;对照组:不添加任何干预措施。主要观察指标:①免疫组织化学α-平滑肌肌动蛋白检测不同浓度转化生长因子β1、罗格列酮干预后成纤维细胞的表型改变。②蛋白免疫印迹检测成纤维细胞中平滑肌α2肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白的表达。结果:不同质量浓度转化生长因子β1诱导成纤维细胞48h后,与对照组相比,5μg/L转化生长因子β1可明显刺激成纤维细胞表型改变及细胞中平滑肌α2肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达,10μg/L转化生长因子β1刺激细胞表型改变及平滑肌α2肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达最明显(P<0.05),随后转化生长因子β1再增加至15μg/L,与10μg/L转化生长因子β1浓度组相比,其刺激细胞表型改变及平滑肌α2肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达不再增加(P>0.05)。不同浓度罗格列酮干预10μg/L转化生长因子β1诱导的成纤维细胞48h后,与对照组相比,30μmol/L可明显抑制成纤维细胞表型改变及细胞中平滑肌α2肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达(P<0.05)。结论:PPAR-γ激动剂罗格列酮能抑制转化生长因子β1诱导体外血管外膜成纤维细胞表型改变及平滑肌α2肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达。

抑制沉默信息调节因子1/p53通路对同型半胱氨酸诱导的心肌纤维化的影响

目的探讨抑制沉默信息调节因子1(SIRT1)/p53通路对同型半胱氨酸(Hcy)诱导的心肌纤维化的影响。方法体外培养心肌成纤维细胞(CF),分为NC组、Hcy组、EX527+Hcy组进行实验。NC组为正常培养的CF;Hcy组的CF给予0.5 mmol/L的Hcy刺激;EX527+Hcy组的CF在给予0.5 mmol/L的Hcy刺激后加入SIRT1/p53通路抑制剂EX527进行干预。干预结束后,检测各组细胞的增殖率、凋亡率,细胞中纤维化相关因子Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)、Ⅲ型胶原α1链(COL3A1)和肌动蛋白α2(Acta2)的mRNA和蛋白表达水平,以及细胞中SIRT1/p53通路相关蛋白SIRT1、乙酰化p53(Ac-p53)的表达水平。结果(1)与NC组比较,Hcy组CF增殖率升高,凋亡率降低(均P<0.05);与Hcy组比较,EX527+Hcy组细胞增殖率降低,而凋亡率升高(均P<0.05)。(2)与NC组比较,Hcy组CF中COL1A1、COL3A1和Acta2的mRNA和蛋白相对表达水平均升高(均P<0.05);与Hcy组比较,EX527+Hcy组CF中COL1A1、COL3A1和Acta2的mRNA和蛋白相对表达水平均降低(均P<0.05)。(3)与NC组比较,Hcy组CF细胞中SIRT1蛋白相对表达水平升高,Ac-p53蛋白相对表达水平降低(均P<0.05);与Hcy组比较,EX527+Hcy组细胞中SIRT1蛋白相对表达水平降低,Ac-p53蛋白相对表达水平升高(均P<0.05)。结论抑制SIRT1/p53信号通路可促进Hcy诱导的CF凋亡,并抑制CF增殖,从而缓解Hcy诱导的心肌纤维化。

慢性病毒性肝炎患者肝组织免疫组织化学研究

目的 探讨病毒性肝炎肝纤维化的发生机制,对115例慢性病毒性肝炎的肝穿刺标本进行免疫组织化学研究.方法 采用免疫组织化学(IHC)染色,在完全相同的实验条件下检测99例慢性乙型肝炎、16例肝硬化的Ⅳ型胶原Ⅳ-C;α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA);基质金属蛋白酶-2(MMP-2);金属蛋白酶组织抑制因子-2(TIMP-2)的表达状况.结果Ⅳ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白在重度肝炎及肝硬化组织中的表达明显高于轻度(A)及中度(B)慢性肝炎(P<0.01);轻、中度两组的MMP-2/TIMP-2>1,而在重度(C)及肝硬化组,MMP-2/TIMP-2<1.结论 Ⅳ-C、α-SMA、MMP-2、TIMP-2在重度及肝硬化组两组中表达明显,而且在重度、肝硬化组中的表达与轻、中度组中的表达比较差异有统计学意义(P<0.05).同时,重度及肝硬化组,MMP-2与TIMP-2的比值失衡.