抑制PAG1表达逆转喉癌细胞原发性放射抗拒机制探讨

目的鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白(phosphoprotein associated with glycosphingolipid microdomains 1,PAG1)是定位于细胞膜脂筏的跨膜接头蛋白,与肿瘤的发生发展有着密切关系。本研究探讨抑制PAG1表达对喉癌细胞原发性放射抗拒的影响。方法针对人PAG1mRNA序列,设计3条特异性shRNA序列,与酶切后的GV248质粒连接形成表达载体。测序鉴定正确后,经脂质体介导分别转染原发性放射抗拒喉癌细胞Hep-2max,荧光定量PCR及蛋白质印迹法验证干扰效果,筛选出最佳靶向序列。进而使用含最佳靶向序列的载体转染Hep-2max细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞。8Gy放射线处理后,流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡情况。结果荧光定量PCR及蛋白质印迹结果显示,PAG1-shRNA1干扰位点的质粒干扰效果最佳,并获得稳定转染细胞模型。流式细胞术检测结果显示,空白对照组、阴性质粒对照组和PAG1干扰组G2/M期细胞所占比例分别为(39.17±1.62)%、(35.58±1.94)%和(45.28±1.68)%,F=9.837,P=0.013 1;细胞凋亡率分别为(28.46±2.43)%、(29.25±2.89)%和(43.68±1.78)%,F=12.67,P=0.011 1。结论抑制PAG1的表达可促进原发性放射抗拒喉癌细胞Hep-2max凋亡,增加G2/M期细胞比例,从而逆转细胞原发性放射抗拒,并为喉癌放射增敏研究提供新的靶点。

PAG1相互作用蛋白的筛选和验证

目的:在原发性放射抗拒喉癌细胞中筛选鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白(PAG1)的相互作用蛋白并验证其相互作用情况。方法:采用免疫沉淀技术通过特异抗体富集PAG1结合蛋白,SDS-PAGE对免疫沉淀复合物进行分离,从胶中切取PAG1结合蛋白条带,质谱鉴定其成分,NCBI数据库检索各个蛋白功能,进一步运用免疫荧光双标法验证互作蛋白。结果:利用免疫沉淀联合质谱分析筛选得到包括整合素β1在内的9个候选蛋白质,免疫荧光双标法证实PAG1与整合素β1能共定位。结论:原发性放射抗拒喉癌细胞中PAG1与整合素β1存在相互作用,为进一步研究PAG1功能奠定基础。