低剂量地西他滨序贯CAG方案治疗MDS-难治性贫血伴有原始细胞过多的临床疗效

目的:通过回顾性分析探讨低剂量地西他滨序贯CAG方案治疗骨髓增生异常综合征-难治性贫血伴有原始细胞过多(MDS-RAEB)的临床疗效。方法:将我院收治的接受低剂量地西他滨序贯CAG方案治疗的36例MDSRAEB患者,纳入地西他滨序贯CAG组;同期将单用地西他滨治疗的M DS-RAEB 40例患者作为对照,比较2组患者临床特征、疗效及不良反应等。结果:序贯CAG组总有效率(ORR)[完全缓解(CR)+部分缓解(PR)+血液学改善(HI)]为83.3%(30/36),明显高于单用地西他滨ORR 62.5%(25/40)(P=0.043),2组不良反应比较无显著差别。地西他滨序贯CAG组最常见的不良反应为3度以上的血细胞减少和感染,在治疗早期(第1-2疗程)比较常见,治疗有效后上述不良反应逐渐减少,其他非血液学不良反应少见。结论:地西他滨序贯CAG方案治疗MDS-RAEB比单用地西他滨疗效更确切,此方案对不适合行造血干细胞移植的患者可能有重要的临床价值。

低剂量地西他滨联合低剂量化疗治疗骨髓增生异常综合征伴原始细胞过多的临床疗效

目的:观察低剂量地西他滨联合低剂量化疗治疗骨髓增生异常综合征伴原始细胞过多(MDS-EB)的临床疗效。方法:88例初诊MDS-EB患者中,34例单用低剂量地西他滨(≤15 mg·m^-2·d^-1)治疗(单药组),54例接受低剂量地西他滨联合低剂量化疗治疗(联合组),比较2组患者临床特征、疗效及不良反应等。结果:联合组MDS-EB-Ⅱ型患者比例高于单药组(P=0.024),IPSS中危-2+高危患者比例高于单药组(P=0.010),余临床特征2组间差异无统计学意义(P>0.05)。单药组CR 7例、mCR 11例、HI 4例、治疗失败12例,联合组分别为26、26、0、2例,联合组总体疗效优于单药组(P<0.001)。联合组总生存时间较单药组延长(P=0.024),2组无进展生存时间差异无统计学意义(P=0.112)。联合组中性粒细胞减少程度较单药组严重(P=0.002),其余不良反应2组间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:低剂量地西他滨联合低剂量化疗较单用低剂量地西他滨治疗MDS-EB疗效好,生存时间长,对不适合行造血干细胞移植的MDS-EB患者更具应用价值。

巨幼贫伴再障误诊为原始细胞过多性难治性贫血21例分析

巨幼细胞性贫血（MA）是由于叶酸、维生素B12缺乏等导致细胞核DNA合成障碍所致的贫血,外周血除血红蛋白降低外,少部分可同时出现粒细胞系和（或）血小板下降,骨髓呈现典型的＂巨幼变＂。而再生障碍性贫血（AA）是一种获得性骨髓造血功能衰竭症．主要表现为骨髓造血功能低下，全血细胞减少。

原始生殖细胞的发育调控及环境雌激素对其毒性效应的研究进展

随着环境雌激素(environmental estrogens,EEs)在人体样本尤其是孕早期人体样本中频繁被检出,对于EEs的生殖健康风险研究开始关注其对原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)发生和迁移的影响。PGCs是生殖细胞的前体细胞,经过特化、迁移、分化后生成精子或卵子,作为高等生物体生命延续的载体,其遗传稳定性对人体生殖健康至关重要。本文以小鼠及斑马鱼为例总结了PGCs发育过程及其关键调控因子,讨论了雌激素在PGCs发育中的作用及其调控方式,在此基础上综述了EEs对PGCs的毒性效应及其分子机制的研究进展。了解EEs对PGCs的毒性效应及分子机制研究进展,将为EEs的人体生殖健康风险评估提供更为精准的科学依据。

诱导化疗时外周血原始细胞清除时间和初诊时白蛋白水平与急性髓系白血病患者基因突变及预后之间的关系

目的 探讨诱导化疗时外周血原始细胞清除(PBBC)时间和初诊时白蛋白(ALB)水平与急性髓系白血病(AML)患者基因突变及预后之间的关系。方法 收集昆明医科大学第二附属医院2017年1月至2023年5月初诊的175例AML患者的临床资料进行回顾性分析,采用ROC曲线确定PBBC的最佳临界值为6.5 d,PBBC≤6.5 d划分为外周血原始细胞清除短时间组(EBC),PBBC> 6.5 d分为外周血原始细胞清除长时间组(DBC);以PBBC和初诊时ALB建立简易预后模型,可以将患者划分为a、b、c 3组,a组(PBBC≤6.5 d、ALB>34.45 g/L,无危险因素),b组(PBBC> 6.5 d、ALB> 34.45 g/L或PBBC≤6.5 d、ALB≤34.45 g/L,1个危险因素),c组(PBBC> 6.5 d、ALB≤34.45 g/L,2个危险因素),对3组患者各基因突变情况及OS进行比较;采用t检验和卡方检验或秩和检验评估各种参数的差异性,Kaplan-Meier法进行生存分析。结果 对影响预后的因素进行COX回归分析显示PBBC和ALB是影响预后的独立因素,差异存在统计学意义(P <0.05);对abc 3组的OS进行组间比较发现,3组中位OS分别为未达到、1.86 a和0.93 a(a组vs b组,P <0.001;a组vs c组,P <0.001;b组vs c组,P=0.001),差异具有统计学意义,得出无危险因素组的OS和PFS均优于1~2个危险因素者。发现3组间CEBPA双突变和NPM1基因突变无统计学意义(P> 0.05),但C-KIT基因突变有统计学意义(P <0.05)。结论 PBBC和ALB是AML患者预后的独立危险因素,以PBBC和ALB组成的简易预后模型可以为精准化、个体化诱导化疗方案的选择提供依据,为判断初诊AML患者的基因突变及预后提供参考。

Rho激酶抑制剂Y27632促进人诱导多能干细胞来源原始神经上皮细胞向多巴胺能神经前体细胞的转化

目的提高人诱导多能干细胞来源原始神经上皮细胞(hiPSCs-NECs)定向诱导中脑多巴胺能神经前体细胞(DAPs)的效率。方法将人iPSCs在含有小分子组合[DMH1(10μmol/L)、SB431542(10μmol/L)、音猬因子(SHH 200 ng/mL)、成纤维细胞生长因8(FGF8100 ng/mL)、嘌吗啡胺(2μmol/L)、CHIR99021(3μmol/L)、N2(1%)]的mTeSRTM培养基中诱导至12 d,细胞分化为原始神经上皮细胞(NECs)。特异性诱导DAPs,将诱导的hiPSCs-NECs用胶原酶IV消化后,在神经分化培养基[添加1%N2、2%B27-A、BDNF(10 ng/mL)、GDNF(10 ng/mL)、AA、TGF-β、cAMP、1%GlutaMax]中加入不同浓度的Rho激酶抑制剂Y27632重新接种,并于次日更换培养基去除Y27632,持续诱导至第28天获得DAPs。结果人iPSCs可在基质胶上稳定传代,表达多潜能性标记物OCT4、SOX2、Nanog和SSEA1,且碱性磷酸酶染色呈阳性。诱导分化至第13天获得hiPSCs-NECs,形成玫瑰花结样结构,能够表达特征性标记物(SOX2、Nestin和PAX6)。将hiPSCs-NECs消化后,添加5μmol/LY27632的hiPSCs-NECs相比较未加Y27632的对照组,细胞解离后贴壁存活率明显增加,处于S期的细胞(P<0.01)与细胞活力显著提高(P<0.01),且凋亡率显著降低(P<0.05),持续诱导至第28天,细胞高表达DAPs特异性的标记物(TH、FOXA2、NURR1和Tuj1)。结论添加Y27632(5μmol/L)24 h可显著提高人iPSCs-NECs细胞向iPSCs-DA神经前体转化时的细胞存活率,并且Y27632去除后,不会影响后续向DA神经前体细胞分化,间接的提高了细胞的分化效率.

鱼类原始生殖细胞发育与生殖操作技术研究进展

原始生殖细胞是胚胎发育过程中最早建立的一群生殖干细胞,是有性生殖动物生殖发育的基础。鱼类原始生殖细胞特化遵循“先成论”的模式,早期胚胎发育过程中获得母源生殖质组分的细胞特化为原始生殖细胞,特化形成的原始生殖细胞需要维持其生殖干细胞命运,并经过长距离迁移最终到达性腺原基的位置。原始生殖细胞特化、迁移和命运维持过程受到多种基因和信号通路的综合调控。研究鱼类原始生殖细胞发育不仅有助于深入理解脊椎动物细胞特化、迁移和命运维持等基本生物学过程的调控机理,而且是开发新的养殖鱼类生殖控制和生殖干细胞移植技术的重要基础。本文概述了鱼类原始生殖细胞发育的基础理论以及生殖操作技术研究进展,并展望了未来的发展趋势,以期为开发重要养殖鱼类优良种质创制新技术提供参考。

利用iCaspase9特异性诱导鸡原始生殖细胞消除的研究

【目的】制备在生殖细胞特异表达iCaspase9的鸡原始生殖细胞系(PGCs),提升外源性PGCs的生殖传递效率,为生产诱导不育的雄性或雌性受体鸡胚打下基础。【方法】利用piggyBac转座子将iCaspase9片段整合到鸡基因组中,构建稳定转染iCaspase9片段的CAG-iCaspase9-mCherry DF-1细胞系,通过荧光微显镜观察鉴定其在iCaspase9系统诱导底物B/B二聚化配体作用下的细胞消除效果;再利用CRISPR/Cas9技术将iCaspase9片段定点插入DAZL基因第11外显子之后构建Dazl-iCaspase9-EGFP PGCs,经iCaspase9片段插入鉴定和PGCs生殖特性鉴定后,通过荧光微显镜观察鉴定其在B/B二聚化配体诱导下的消除效果。【结果】成功建立的CAG-iCaspase9-mCherry DF-1细胞系与野生型DF-1细胞(WT DF-1)的生长增殖无显著差异(P>0.05,下同);CCK-8法测定发现,0.25~5.00 nmol/L B/B二聚化配体对WT DF-1细胞生长数量无显著影响,但CAG-iCaspase9-mCherry DF-1细胞在添加B/B二聚化配体后,细胞数量较空白对照组极显著降低(P<0.01,下同),且失去正常的细胞形态,逐渐变圆甚至凋亡。成功建立的DAZL-iCaspase9-EGFP PGCs仍特异性高表达Cvh、Nanog、PouV、DAZL、Cdh和Ddx4等生殖细胞相关基因,在蛋白水平上也能鉴定出DAZL、SSEA1和CVH等蛋白,说明插入iCaspse9片段后并没有改变生PGCs的殖细胞特异性;在0.25 nmol/L B/B二聚化配体诱导作用下,DAZL-iCaspae9-EGFP PGCs数量显著减少,几乎全部消除,说明iCaspase9系统可诱导细胞凋亡而有效消除内源性PGCs。【结论】利用i Caspase9系统构建获得的DAZL-iCaspase9-EGFP PGCs在不改变其生殖细胞特性的同时,可在B/B二聚化配体诱导下有效消除内源性PGCs,为建立高效鸡种质资源恢复和基因编辑鸡制备等研究提供无内源性PGCs的受体鸡胚。

LncRNA PGCT8正向调控鸡原始生殖细胞形成

研究旨在对前期测序筛选到的关键LncPGCT8对鸡原始生殖细胞(PGCs)形成的影响进行深入探究。试验通过qRT-PCR和组织表达谱分析LncPGCT8在鸡PGCs和生殖嵴中的表达量。在体内外过表达/干扰LncPGCT8,通过qRT-PCR、流式细胞术、间接免疫荧光和免疫组织化学染色检测体内外PGC形成效率。结果显示:LncPGCT8在鸡PGCs和性腺中均显著高表达(P<0.05),过表达LncPGCT8组PGCs形成效率显著高于对照组(P<0.05),干扰LncPGCT8则会显著降低PGCs形成数量(P<0.05)。结果表明LncPGCT8在体内/外均促进鸡PGCs形成,为提高体外诱导PGCs效率奠定理论基础。

儿童颅外生殖细胞肿瘤诊疗专家共识(CCCG-GCTs-2021)

一、背景生殖细胞肿瘤(germ cell tumors,GCTs)发生于原始生殖细胞,在胚胎发育过程中沿肠系膜迁移到生殖腺^([1])。儿童颅外生殖细胞瘤(extracranial germ cell tumors,EGCTs)是指发生在颅外的GCTs,约占儿童癌症的3.5%^([2]),在青少年(15~19岁)中,这一比例增加到14%^([3-4])。

原始生殖细胞的人类胚胎干细胞克隆

取材于妊娠终止胚胎生殖腺或生殖嵴及其周围组织，用ＤＭＥＭ＋ＮＣＳ培养液体外培养，分离由人ＰＧＣｓ转化成的类ＥＳ细胞，并将其与同源胚胎成纤维细胞一起用胰蛋白酶＋ＥＤＴＡ的无钙镁ＰＢＳ液消化传代。在原代培养１２ｈ观察到胞体较大、边缘不整、贴壁分裂增殖的ＰＧＣｓ样细胞，４８ｈ后观察到２６处紧密排列呈鸟巢状的类ＥＳ细胞集落及集落团。第６ｄ传代成功，第１６ｄ传至第４代。结果表明，体外培养附植后胚胎能够建成人的类ＥＳ细胞系。

牛原始生殖细胞的分离与培养

从4～15周龄的牛胎儿生殖嵴中分离得到牛原始生殖细胞,以STO(一种建系的小鼠胎儿成纤维细胞)及MEF(小鼠胎儿成纤维细胞)为饲养层抑制分化培养,其中1个细胞系传至4代。研究发现,STO较MEF更有利于牛类EG细胞的分离与培养,体长小于5cm的胎儿适合牛EG细胞分离与克隆。同时观察到这些细胞在体外进行自发性分化,可形成上皮样细胞、神经样细胞和成纤维样细胞。

流式细胞术分析骨髓增生异常综合征患者原始细胞免疫表型特点及其在诊断中的意义

本研究应用流式细胞术分析骨髓增生异常综合征(MDS)RAEB-1和RAEB-2亚型患者原始细胞免疫表型特点并探讨其在MDS诊断中的意义,同时分析比较流式细胞术和骨髓涂片计数的原始细胞比例。应用流式细胞术对29例患者骨髓原始细胞进行设门,计数其比例并分析相关抗原的表达情况。结果表明,①流式细胞术和骨髓涂片检测RAEB-1与RAEB-2亚型患者骨髓原始细胞比例差异无统计学意义(P>0.05);②13例RAEB-1亚型患者,原始细胞阳性表达CD34、HLA-DR、CD117、CD33、CD13、CD15、CD11b、CD3、CD19、CD7、CD56的患者分别有10例、12例、8例、11例、11例、3例、7例、0例、0例、3例、2例;16例RAEB-2亚型患者,原始细胞阳性表达上述抗原的患者分别有12例、13例、3例、12例、15例、7例、5例、0例、1例、4例、2例;RAEB-1与RAEB-2亚型间各种抗原的表达差异均无统计学意义(P>0.05);③29例患者中原始细胞跨阶段表达CD15、CD11b的患者分别有10例、12例;④29例患者中原始细胞跨系列表达CD3、CD19、CD7、CD56的患者分别有0例、1例、7例、4例。结论:应用流式细胞术对MDS患者原始细胞进行免疫表型分析,可以为诊断及鉴别诊断MDS提供重要参考信息。

不同发育阶段人胚胎原始生殖细胞的定位及体外培养

目的 :对不同发育阶段的人胚胎原始生殖细胞 (PGC)进行定位并比较其体外培养的差异。 方法 :取 4～ 7周发育阶段的人胚胎 ,应用组织化学法检测PGC内碱性磷酸酶 (AP)以对其定位。体外分离人胚胎生殖嵴和肠系膜组织进行培养 ,第 1次传代后 ,用AP标记 ,计数不同发育阶段AP阳性的PGC和体外培养的阳性克隆并进行比较。 结果 :在卵黄囊、原肠、背侧肠系膜和生殖嵴处有AP强阳性细胞 ,阳性信号位于胞质内。阳性细胞散在分布 ,在生殖嵴处聚集成团。不同发育阶段的胚胎组织培养均有阳性克隆出现。统计学分析结果表明 ,4～ 7周人胚胎内AP阳性的PGC数目及细胞内信号强度无明显差异(P >0 .0 5 ) ;由胚胎组织培养获得的AP阳性克隆数也无显著差异。 结论 :人PGC位于卵黄囊、原肠、背侧肠系膜和生殖嵴处。 4～ 7周发育阶段 。

鸡胚不同发育时期原始生殖细胞的分离方法

采用Ficoll密度梯度离心法和EDTA 胰酶酶解法两种方法 ,分别提取第 14期 (孵化 5 3h)血液、第 19期 (孵化 72h)和第 2 8期 (孵化 132h)生殖腺中的PGCs,以比较两种分离方法对 3个发育时期的鸡胚原始生殖细胞在相同体外培养条件下存活时间的差异。结果发现 ,两种分离方法均能分离到一定数量的原始生殖细胞 ,但是酶解法分离到的原始生殖细胞的相对数量较Ficoll密度梯度离心法的多 ,存活时间较长 ,是一种适宜的分离方法 ;对鸡胚发育第 14、 19、 2 8期 3个时期提取的原始生殖细胞进行体外培养 ,存活时间分别为 :72h、 88h和 80h ,三者之间差异显著。结果表明 :在鸡胚孵化的第 19期 ,因原始生殖细胞大量聚集在肢体后端的生殖嵴原基处 ,因而较容易收集 ,体外培养较为适宜 。

正常核型急性髓系白血病NPM1、FLT3-ITD突变与外周血白细胞数及骨髓原始细胞百分比相关性研究

本研究旨在分析NPM1和FLT3-ITD突变与急性髓系白血病患者外周血白细胞数及骨髓原始细胞百分比的相关性。回顾分析我中心2009年1月至2011年12月份初治正常核型急性髓系白血病患者51例,其中男性22例,女性29例,中位年龄47岁(14-83岁)。采用聚合酶链式反应检测NPM1及FLT3-ITD突变状态。结果表明,与无NPM1突变患者相比,突变者初诊时外周血白细胞数较多(30.7×109/L vs 8.6×109/L,P=0.002);FLT3-ITD突变患者较无突变患者具有更多的外周血白细胞数(42.38×109/L vs 11.45×109/L,P=0.033)及更高的骨髓原始细胞百分比(74.0%vs 60.25%,P=0.036)。外周血白细胞数及骨髓原始细胞百分比在NPM1、FLT3-ITD无突变组、单独NPM1突变组、单独FLT3-ITD突变组到NPM1、FLT3-ITD双突变组逐步升高(均P<0.05)。白细胞数大于12.55×109/L的患者NPM1突变率明显升高(P=0.002),大于37.85×109/L者FLT3-ITD突变率明显升高(P=0.033);原始细胞比例大于72.25%的FLT3-ITD突变率明显升高(P=0.008)。NPM1突变患者首疗程完全缓解率(CR)明显高于无突变者(78.13%vs 40.0%,χ2=4.651,P=0.031)。结论:NPM1及FLT3-ITD突变患者白细胞计数及原始细胞比例大,提示NPM1与FLT3-ITD突变均可能促进白血病细胞增殖,且二者可能具有协同效应。

从原始生殖细胞分离克隆鸡胚胎生殖细胞的研究

从孵化 5 5天的鸡胚生殖腺中分离得到大量原始生殖细胞 (PGCs)集落 ,这些集落的细胞经多次克隆传代具有胚胎生殖细胞 (EG)的诸多特征 ,如有连续传代的能力 (传至第 9代 ) ,细胞集落有典型鸟巢状结构 ,PAS染色阳性 ,AKP染色阳性 ,在无饲养层无分化抑制因子LIF时可以自发分化成几种细胞类型 ,包括成纤维细胞、神经细胞、自律细胞等 ,悬浮培养时具有形成类胚体的能力。上述发现表明该细胞具EG细胞的诸多特性 。

不同时期鸡胚原始生殖细胞的分离及存活时间的研究

采用Ficoll密度梯度离心,提取第14期(孵化53h)血液、第19期(孵化72h)和第28期(孵化132h)性腺中的PGCs,以比较这3个时期的PGCs在相同的体外培养条件下存活时间的差别。培养基为TCM 199,添加10%的小牛血清,不添加其他的细胞因子,培养后采用台盼蓝染色,以比较其在这种培养液中存活时间的差别。结果发现,第14期提取的PGCs存活时间最短,第19期的最长,第28期的介于两者之间。

冷冻保护剂和平衡方法对鸡胚原始生殖细胞冷冻保存效果的影响

采用Ficoll密度梯度离心,提取第19期(孵化72h)和第28期(孵化132h)性腺中的原始生殖细胞(PGCs),应用不同的冷冻保护剂和平衡方法进行冷冻保存。PGCs解冻后用DMEM培养液进行体外培养,并采用苔盼蓝染色法鉴定复苏后PGCs的存活情况。结果表明:1从第19期或第28期性腺中获取的PGCs在同一种冷冻保护剂下,平衡方法对PGCs的存活率有显著或极显著影响,平衡方法1的冷冻保护效果优于平衡方法2。2采用相同的平衡方法,冷冻保护剂C的冻存效果与其他保护剂之间存在显著或极显著差异,冷冻保护剂E和F对PGCs的冻存效果次之,冷冻保护剂A、B和D对PGCs的冻存效果最差。复苏后PGCs进行体外培养,其存活时间与分离后PGCs直接培养相比未出现显著缩短现象。

地塞米松对骨髓增生异常综合征患者原始细胞构成影响及其在诊断中的意义

目的:为了解地塞米松对骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓原始细胞构成变化的影响并探讨其在诊断MDS中的意义。方法:应用流式细胞术对30例MDS确诊患者骨髓细胞进行设门分析,其中10例分析前使用过地塞米松作为治疗组,另20例未使用地塞米松作为对照组,计算其比例并分析相关抗原的表达情况。结果:治疗组和对照组CD34^+细胞比例差异没有统计学意义(P>0.05)。地塞米松治疗组B淋巴早期细胞(CD34^+/CD19^+/CD10^+细胞)比例明显增高且髓系早期细胞(CD34^+/CD117^+细胞)占CD34^+细胞比例明显降低,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。治疗组与对照组粒细胞和单核细胞其他抗原表达差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:地塞米松使MDS患者骨髓中早期B淋巴细胞比例明显增高,髓系早期细胞比例明显降低,明显影响CD34^+原始细胞构成。