Reteplase(K)原核分泌表达载体的构建及其初步表达

在原核表达载体pErA(K)的基础上,构建新型原核分泌表达载体pBrA(K),并实现其在原核表达系统中的表达。用限制性内切酶NcoI,XhoⅠ同时双酶切获得目的基因rPA(K)后,以T4连接酶将其连接到pET-20b(+)上,构建新型原核分泌表达载体pBrA(K)并实现了在大肠杆菌中表达,经纤维蛋白平板检测存在于重组菌株培养液上清中的分泌蛋白有溶纤活性。ELISA结果显示表达产物与抗t-PA抗体呈现特异性阳性反应,进一步参考标准曲线得出样品中rPA(K)的平均含量为51 ng/mL。实验结果证明新型原核分泌表达载体pBrA(K)构建成功,并实现了其在原核表达系统中的表达,为新型rPA(K)的表达优化及后续的纯化研究工作奠定了基础。

带有HIV Tat-蛋白转导域的人成熟神经生长因子的分泌表达及鉴定

HIV-Tat蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)是一个公认的具有介导靶蛋白跨膜作用的肽段。为了表达出可溶的并具有生物学活性的PTD-NGF融合蛋白,作者首先根据人神经生长因子成熟肽(hNGFm)的基因序列设计引物,利用PCR技术直接从人胎盘的基因组DNA中扩增出hNGFm的编码序列,同时利用PCR引物在其5和3末端分别加上HIV-Tat-PTD及组氨酸标签(His-Tag)的序列,然后将PCR产物克隆于原核表达质粒pET22b中pelB leader的下游,构建分泌表达质粒pET22b-PTD-hNGFm-His,将该质粒转入宿主大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE检测显示有两种表达产物,Mr分别为16ku和18.4ku,分别位于大肠杆菌周质腔和细胞质中,两者均可与抗hNGF抗体反应。周质腔表达产物(PTD-hNGFm-His)经Ni2+螯合亲和层析纯化后纯度达98%以上,纯化的PTD-hNGFm-His融合蛋白刺激神经突起生长的最适浓度为20ng/ml。因此成功构建了PTD-hNGFm-His分泌表达载体并在大肠杆菌中进行了分泌表达,得到了可溶且具有生物活性的PTD-hNGFm-His融合蛋白。