LHCGR胞外结构域蛋白的生信分析、原核表达及纯化

目的为获得小鼠LHCGR胞外结构域蛋白(LHCGR-1),分析其结构及理化性质,为今后研究该蛋白功能及筛选与之相互作用的小分子化合物奠定基础。方法根据NCBI中小鼠LHCGR氨基酸序列合成目的基因Lhcgr-1,经生物信息学分析后,将该基因插入至表达载体pET-28a(+),并转化至BL21(DE3)感受态细胞中;经IPTG诱导,表达重组蛋白pET-28a-LHCGR-1,利用SDS-PAGE和Western Blot进行鉴定,之后对该蛋白进行纯化,并通过分子对接技术预测该蛋白与LH、CG的相互作用。结果预测LHCGR-1蛋白分子量为40749.08,由367个氨基酸组成,等电点理论值为5.47;氨基酸序列中有29个丝氨酸位点、10个苏氨酸位点和5个酪氨酸位点;成功构建了表达载体pET-28a-LHCGR-1并获得纯化的目的蛋白;分子对接结果表明目的蛋白可以与LH、CG通过多种相互作用,形成稳定的复合物,有利于其发挥原有的生物学功能。结论成功构建了小鼠胞外结构域蛋白LHCGR-1在大肠杆菌内的原核表达体系并获得了纯化蛋白,分子对接预测该蛋白具有生物学功能,提示该蛋白可以用于后续研究。

气单胞菌属低温淀粉酶基因改造与原核表达

【目的】获取低温淀粉酶基因,分析其相关功能,为工业生产上的应用提供参考。【方法】以气单胞菌(Aeromonas)LA77为出发菌株克隆低温α-淀粉酶基因,以BL-21(DE3)为宿主菌进行克隆。分析其它已知气单胞菌属低温α-淀粉酶基因同源性,设计特异引物,PCR扩增获得C13片段,将其克隆到pMAL-2X,转化到BL-21(DE3)中,筛选蓝白斑,验证PCR及EcoRⅠ和HindⅢ的双酶切,获得高效表达生物工程菌株pMAL-2X-C13。设计定点突变引物,以pMAL-2X-C13为模板,获得低温淀粉酶基因突变株三株C19、C29、C43。【结果】表达蛋白的分子大小为114kD,突变菌株C19蛋白表达量均高于pMAL-2X-C13。【结论】低温淀粉酶基因突变株C19比原始菌株pMAL-2X-C13淀粉酶基因蛋白表达量更高。

斑点叉尾鮰ZBTB38的原核表达、多克隆抗体制备及应用

为获得斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)ZBTB38的多克隆抗体,并研究其在性腺中的表达情况,将斑点叉尾鮰zbtb38基因部分序列经密码子优化后连接至pET32a(+)载体,构建重组质粒pET32a(+)-zbtb38,再转入大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞BL21(DE3)中诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(Western blot)和液相色谱-质谱联用(LC-MS)等技术进行鉴定。用纯化后的重组蛋白制备兔抗斑点叉尾鮰ZBTB38多克隆抗体,通过酶联免疫吸附(ELISA)和Western blot技术检测抗体效价及其特异性,最后采用Western blot方法检测ZBTB38在性腺中的表达情况,并使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对检测结果进行验证。结果表明,制备的兔抗斑点叉尾鮰ZBTB38多克隆抗体效价可达1:(5.12×10^(5)),能够特异性识别斑点叉尾鮰性腺组织中表达的ZBTB38蛋白,其中精巢组织中的表达水平显著高于卵巢,Western blot与qRT-PCR检测结果较为一致。综上所述,研究成功制备了斑点叉尾鮰ZBTB38的多克隆抗体,为下一步深入研究斑点叉尾鮰zbtb38基因的功能奠定了基础。

溶血素 E基因原核表达载体的构建与蛋白诱导表达

目的构建大肠杆菌(Escherichia Coli,E.coli)溶血素E(Hemolysin E)基因的重组质粒pCZN1-hlyE,诱导表达目的蛋白。方法通过NCBI数据库检索获取E.coli Hemolysin E基因序列(NC_000913.3),采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的全基因合成法,设计全长拼接引物,合成目的基因,并成功构建重组质粒pCZN1-hlyE。将构建好的pCZN1-hlyE重组质粒转入大肠杆菌TOP10菌株中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导Hemolysin E基因的表达,生成Hemolysin E毒力蛋白。结果经SDS-PAGE凝胶电泳,Western blot分析鉴定目的蛋白Hemolysin E分子量为28.72 kDa,与Hemolysin E基因核酸序列经DNAMAN软件分析所得蛋白分子量一致。结论被诱导表达的Hemolysin E蛋白存在于菌体裂解液上清中,并纯化制备重组蛋白。

棉花GhMYB42基因的克隆及原核表达

MYB转录因子对棉花的生长发育起到重要作用,而GhMYB42为MYB家族之一的转录因子同样具有一定的研究价值,因此,从棉花中克隆了GhMYB42基因的编码序列,并构建了原核表达载体。利用生物信息学方法对GhMYB42的核苷酸序列及氨基酸序列进行了分析,通过Gataway BP和LR反应,将GhMYB42基因的编码序列构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,通过设置不同的IPTG诱导条件来确定IPTG诱导蛋白的最佳条件,最后利用Western Blot鉴定重组蛋白。结果显示,GhMYB42(XP_016732693.1)全长序列1508 bp,编码区长792 bp,编码263个氨基酸,预测分子量约为29.534 ku,等电点为5.18。氨基酸序列比对分析发现,MYB转录因子的序列相似率为80.62%,且GhMYB42蛋白N末端含有2个串联的SANT结构域,是一个R2R3转录因子。进化树分析结果显示,陆地棉MYB42蛋白与陆地棉中另一MYB蛋白(XP_012439547.1)相似性最高并在一个分支上。蛋白诱导时由于各个试验梯度结果差别不明显,因此,选择的条件为IPTG的终浓度0.2 mmol/L,温度37℃,时间3 h,蛋白溶解的温度和时间为37℃诱导3 h。Western Blot结果表明,重组蛋白的大小正确,最终成功获得了大小为55.54 ku的GhMYB42重组蛋白,后续将对该重组蛋白进行纯化及深入研究转录因子GhMYB42的功能。

河虾过敏原原肌球蛋白的基因克隆与原核表达

为了探寻天然原肌球蛋白的可替代物作为诊断和治疗虾类过敏的基础材料,本研究从河虾中提取总RNA,利用cDNA末端快速扩增技术克隆河虾过敏原原肌球蛋白基因的全长序列。以此序列设计表达引物,构建表达载体,最后通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达重组原肌球蛋白。结果显示,河虾的原肌球蛋白基因cDNA序列全长1658 bp,开放阅读框855 bp,编码284个氨基酸,预测蛋白等电点4.70,预测分子质量32.8 kDa。河虾原肌球蛋白cDNA序列已上传至GenBank数据库,登录号为OP974621。本研究成功构建河虾原肌球蛋白重组表达质粒pET-30a-TM,并用IPTG进行体外诱导表达,最佳诱导条件为IPTG浓度1 mmol/L、37℃诱导4 h。可溶性分析结果表明重组原肌球蛋白主要以可溶性形式存在于细胞破碎液的上清液中,分子质量约38 kDa。

鸡FGL2基因的克隆分析及原核表达

【目的】克隆鸡纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein 2,FGL2)基因,并进行生物信息学分析和原核表达,为鸡FGL2蛋白的功能研究奠定基础。【方法】采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术扩增鸡FGL2基因,克隆至pMD19-T载体,测序后对鸡FGL2基因及其编码的蛋白进行生物信息学分析。构建原核表达质粒pET-32a-FGL2,将其转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。【结果】成功克隆了鸡FGL2基因的CDS区,序列全长为1320 bp,编码439个氨基酸。生物信息学分析显示,鸡FGL2氨基酸与火鸡、雉鸡、珍珠鸡、鹌鹑等禽类的同源性高,达96%以上;与哺乳类动物的同源性较低,其中与犬的同源性仅有64.8%。FGL2蛋白由439个氨基酸组成,理论分子质量为50.24 ku,分子式为C_(2221)H_(3451)N_(615)O_(673)S_(22),理论等电点(pI)为8.63,为不稳定的亲水性分泌型蛋白,无跨膜区。成功构建了原核表达质粒pET-32a-FGL2,其在大肠杆菌BL21(DE3)可表达以包涵体形式为主的FGL2融合蛋白,分子质量约为70 ku。【结论】成功克隆出了1320 bp的鸡FGL2基因,明确了其编码蛋白的生物学信息,经诱导表达后获得FGL2重组蛋白。

新孢子虫硫氧还蛋白的生物信息学分析及其原核表达的鉴定

为研究新孢子虫硫氧还蛋白(Trx)的生物学特性,本研究利用PCR扩增犬新孢子虫Trx(NcTrx)基因的编码区序列,构建pET-32a(+)-NcTrx原核表达载体,经双酶切与测序鉴定正确后,利用系列生物信息学软件分析NcTrx基因及其编码氨基酸序列的生物信息学特征,并对其蛋白互作网络中排名前100的蛋白进行GO功能和KEGG信号通路的富集分析。重组质粒中NcTrx基因的测序结果显示,NcTrx基因片段为1 287 bp,编码428个氨基酸;该蛋白含1个信号肽,1个跨膜区,主要位于内质网上;NcTrx蛋白的二、三级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲组成,有12个B细胞抗原表位;该蛋白属于硫氧还蛋白家族,存在典型的氧化还原基序“-CXXC-”,有38个磷酸化位点、10个O-糖基化位点;与NcTrx蛋白互作最强的为酪氨酸激酶样蛋白,二者通过氢键和静电作用实现相互对接;GO功能及KEGG信号通路的显著性富集分析结果显示,NcTrx与其互作的蛋白主要参与蛋白质转运、蛋白质二硫键异构酶活性等生物学过程,与内质网蛋白质加工、硫代谢等信号通路密切相关。将pET-32a(+)-NcTrx转化BL21(DE3)感受态细胞,并经IPTG诱导表达后采用镍亲和层析法纯化重组NcTrx蛋白(rNcTrx),经SDS-PAGE检测该蛋白的表达及纯化效果,采用Bradford法测定纯化蛋白的浓度。采用western blot鉴定rNcTrx的反应原性。SDS-PAGE结果显示,rNcTrx分子量约66 ku,主要以包涵体的形式表达,且纯化效果较好,浓度为0.8 mg/mL。Western blot检测结果显示,纯化的rNcTrx能够与鼠His MAb、新孢子虫感染的小鼠血清发生特异性反应,在66 ku处出现特异性条带。本研究首次经PCR扩增NcTrx基因,对NcTrx基因及其蛋白进行了生物信息学分析,并经原核系统表达及鉴定了NcTrx蛋白,为后续深入探究该蛋白的生物学功能提供参考依据。

鸡白细胞介素-2原核表达及其活性鉴定

试验旨在获得具有生物活性的鸡白细胞介素-2(ChIL-2)重组蛋白。试验以克隆获得的ChIL-2基因为模板,分别构建原核重组表达菌BL21(pCold-ChIL-2)和BL21(pGEX-6P-1-ChIL-2),进行诱导表达和纯化;通过BrdU ELISA法检测重组蛋白诱导鸡脾脏淋巴细胞的增殖情况,评估其生物活性;以rHis-ChIL-2免疫小鼠制备多克隆抗体。结果显示:成功构建了原核重组表达菌BL21(pCold-ChIL-2)、BL21(pGEX-6P-1-ChIL-2);经表达纯化后分别获得纯度较高的rHis-ChIL-2和rGST-ChIL-2蛋白,大小分别为14 ku和39.4 ku;rHis-ChIL-2和rGST-ChIL-2蛋白分别能够促进脾脏淋巴细胞显著或极显著增殖(P<0.01或P<0.001),均具有良好的生物活性;以纯化的rHis-ChIL-2免疫小鼠制备的多克隆抗体效价为5.12×105,可识别rHis-ChIL-2和rGST-ChIL-2,与真核表达的ChIL-2蛋白反应。结果表明,原核表达的重组蛋白ChIL-2具有良好的生物活性,采用其制备的多克隆抗体可识别真核表达的ChIL-2蛋白,为后期ChIL-2的检测奠定基础。

A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

A型塞内卡病毒(SVA)是一种新兴的猪病原体,可引起母猪水泡样病变和仔猪急性死亡。本研究将SVA的VP1基因分别克隆到原核表达载体pCold-I和pCold-TF,并将测序正确的重组质粒VP1-pCold-I、VP1-pCold-TF转化BL21(DE3)大肠杆菌中,诱导表达重组蛋白。结果显示:VP1-pCold-I表达的目的蛋白在沉淀(包涵体)中,VP1-pCold-TF表达的蛋白为可溶性蛋白。分别纯化上述表达的蛋白,并免疫BALB/c小鼠,经四次免疫后得到多克隆抗体。经Western blot和间接免疫荧光(IFA)鉴定,制备的多克隆抗体具有良好的Western blot效价和IFA效价,为相关基础研究和应用研究提供了工具。

芦笋皂苷合成相关糖基转移酶基因克隆及原核表达分析

【目的】克隆芦笋(Asparagus officinalis)甾醇糖基转移酶基因AoSGT1,分析其潜在催化活性,为解析芦笋皂苷合成途径及代谢调控机制提供科学依据。【方法】基于芦笋转录组数据设计特异性引物,扩增AoSGT1基因的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),经测序验证获得目标基因序列并进行生物信息学分析;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RTqPCR)测定各组织基因表达量;构建pGEX-4T-3-AoSGT1原核表达载体,并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(De3),随后诱导实现重组蛋白表达。【结果】AoSGT1长1800 bp,编码599个氨基酸,其相对分子质量为66.72 kD,属于亲水性蛋白,无跨膜域和信号肽。系统发育结果表明,AoSGT1与盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis)Dz3GT_(2)有较高同源性,同属UGT80B1亚家族。多序列比对揭示了该蛋白序列包含甾醇糖基转移酶保守结构域PSBD Box和PSPG Box,预示其具有对甾体化合物3β-OH位点潜在糖基化活性。RT-qPCR结果显示,AoSGT1在芦笋根中高表达,而在茎和花中低表达。此外,SDS-PAGE结果表明,目标蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达,其大小与预测值相符。【结论】成功克隆AoSGT1基因,并确认其在芦笋中呈现组织特异性表达,推测其可能参与芦笋甾体皂苷生物合成。同时,成功在大肠杆菌中实现了目标蛋白的异源表达。

副鸡禽杆菌lpxM蛋白的原核表达及免疫原性研究

[目的]探究副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)外膜蛋白lpxM的免疫原性,为预防鸡传染性鼻炎提供理论参考。[方法]构建pET-28a-lpxM原核表达载体,经PCR扩增和双酶切鉴定后将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,并对诱导时间和诱导浓度进行优化,用尿素缓冲液纯化重组蛋白lpxM并进行SDS-PAGE分析。利用Western blotting鉴定重组蛋白的特异性。将重组蛋白与MONTANIDEISA 71 VG佐剂制备成疫苗v-lpxM,通过动物试验观察重组蛋白的免疫效果。[结果]重组质粒pET-28a-lpxM转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后成功表达,在37 ku处有目的蛋白特异性条带,在37℃、700 mmol/L IPTG、诱导4 h时蛋白表达量最高;重组蛋白lpxM在上清和沉淀中均有表达,且在沉淀中表达量相对较高;Western blotting结果显示,C型副鸡禽杆菌Modesto株的阳性鸡血清与纯化后的重组蛋白可发生免疫反应。免疫保护试验结果显示,v-lpxM疫苗对A、B和C型副鸡禽杆菌的保护率分别为0、20%和60%。[结论]本研究成功构建了原核表达载体pET-28a-lpxM,实现了lpxM重组蛋白的高效表达,且表现出良好的免疫原性。研究结果为探究副鸡禽杆菌外膜蛋白lpxM的免疫学特性以及为鸡传染性鼻炎的预防和疫苗的研发奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白原核表达及间接ELISA方法的建立

为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)N蛋白多克隆抗体,建立检测PRRSV N蛋白抗体的间接ELISA方法,通过PCR扩增N蛋白基因,将N蛋白基因克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-N。将重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中,通过IPTG诱导N蛋白表达,将纯化后的重组N蛋白免疫小鼠,获得N蛋白多克隆抗体。将纯化后的N蛋白作为抗原,建立检测PRRSV N蛋白抗体的间接ELISA方法,并评估该方法的特异性、重复性和准确性。结果表明,表达的重组N蛋白呈可溶性,制备的N蛋白多克隆抗体ELISA效价能达到1∶2048000,IFA和Western blot结果表明制备的鼠多克隆抗体能特异性识别PRRSV N蛋白。建立的间接ELISA方法特异性良好,重复性试验变异系数均小于10%,且与同类型商品化试剂盒结果比较,符合率达到91.10%,可为PRRSV N蛋白的免疫学检测和结构功能的研究提供参考。

克氏原螯虾虾青蛋白A2基因克隆、组织分布及原核表达

虾青蛋白对甲壳类水产品色泽的形成和调控具有重要作用。为探究克氏原螯虾虾青蛋白A2(PcCRA2)的基因结构及原核表达,作者通过基因克隆获得PcCRA2基因编码序列(cra2),采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测cra2基因在克氏原螯虾9种组织中的表达模式,并以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,进行PcCRA2异源重组表达。结果表明,克氏原螯虾cra2基因cDNA全长573 bp,编码190个氨基酸。生物信息学分析显示,虾青蛋白A2相对分子质量为21 158.9,理论等电点为5.59。氨基酸序列比对发现,克氏原螯虾cra2编码蛋白质序列与红螯螯虾相似度最高,为91.58%。RT-qPCR结果显示,cra2在所检组织中均有表达,在表皮的表达量最高(P<0.05)。构建了pET28a-cra2原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达。其最佳诱导表达条件为:接种4 h后加入0.5 mmol/L IPTG于30℃诱导6 h;UV-vis结果表明重组蛋白质能与虾青素特异性结合,最大吸收峰为505 nm。该研究结果为进一步研究虾青蛋白质的生物功能奠定基础。

血清4型禽腺病毒Fiber蛋白的原核表达及其在抗体检测中的应用

为建立特异的血清4型禽腺病毒(FAdV-4)血清学抗体检测技术,试验将FAdV-4纤突蛋白基因fiber-2克隆至载体pET-28a中,构建原核表达载体pET-28a-Fiber-2,获得纯化的重组蛋白His-Fiber-2,以纯化的His-Fiber-2作为包被抗原建立检测Fiber-2抗体的间接ELISA方法,对该方法进行特异性、重复性、稳定性、灵敏性试验,并与BioChek FAdV商品化ELISA试剂盒检测结果进行比较。结果显示:建立的ELISA仅与抗FAdV-4阳性鸡血清发生反应,与检测的抗其他病原的血清以及SPF鸡血清均无反应性,批间重复性与批内重复性良好,其变异系数分别在4.345%~6.983%和4.326%~9.391%之间,包被酶标板保存12个月后,变异系数为4.4%~10.0%,其检测灵敏度是间接免疫荧光检测技术的8~32倍,是基于包被GST-Fiber-2蛋白ELISA的2倍;建立的ELISA对FAdV-4灭活疫苗免疫的鸡血清检出率高于BioChek试剂盒,两者对临床感染FAdV-4的鸡血清的检测结果一致。研究表明,试验构建的基于重组蛋白His-Fiber-2的检测FAdV-4抗体的间接ELISA方法为临床上FAdV-4感染监测以及疫苗的免疫评价提供了技术,具有良好的应用前景。

非洲猪瘟病毒MGF360-13L蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒(ASFV)MGF360-13L基因原核表达系统表达13L蛋白,并制备其鼠源多克隆抗体。利用生物信息学方法,对ASFV MGF360-13L基因进行序列比对,分析其同源性、构建遗传进化树;将非洲猪瘟病毒MGF360-13L基因密码子优化后进行合成,连接至PET32a载体构建重组质粒pET32a-13L,转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达获得目的蛋白,采用镍柱纯化法进行蛋白纯化。将纯化后的蛋白乳化后免疫8周龄BALB/c雌鼠制备多克隆抗体,间接ELISA和Western blot检测抗体特异性。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白分子量大小为58.2 kDa,主要以包涵体形式存在;Western blot结果显示免疫猪阳性血清可特异性识别该蛋白,具有良好的反应性,表明该重组蛋白获得正确表达。利用该蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体进行Western blot,结果显示其能与MGF360-13L重组蛋白发生特异性反应。间接ELISA测定抗体效价高达1∶256000。本研究成功制备非洲猪瘟病毒MGF360-13L重组蛋白,以其为免疫原制备的多克隆抗体具备较高的特异性和反应性,为进一步阐述MGF360-13L蛋白的生物学功能和研制非洲猪瘟新型疫苗奠定了基础。

细粒棘球绦虫膜联蛋白B5、B15和B25的原核表达和分泌特性分析

旨在探讨细粒棘球绦虫膜联蛋白B5、B15和B25的反应原性及其在中间宿主组织中的分泌特性,为进一步研究细粒棘球绦虫膜联蛋白与中间宿主的相互作用奠定基础。作者提取细粒棘球蚴原头蚴的总RNA并反转录为cDNA,以cDNA为模板PCR扩增获得EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25基因全长编码序列,使用同源重组法构建pET32a-EgANXB5、pET32a-EgANXB15和pET32a-EgANXB25质粒并进行重组蛋白的原核表达,应用蛋白免疫印迹对上述重组蛋白进行鉴定,并采用免疫荧光染色试验分析EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25在中间宿主组织中的分泌特性。结果显示:本研究成功克隆并表达出重组EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25,并更正了EgANXB25的CDS序列(GenBank:OR245515.1)。蛋白免疫印迹结果显示,这3种蛋白均能够被感染细粒棘球绦虫的犬阳性血清和感染细粒棘球蚴的小鼠阳性血清所识别。同时,免疫荧光染色结果显示,在细粒棘球蚴包囊附近的肝实质组织中可以检测到EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25的阳性信号。EgANXB5、EgANXB15和EgANXB25具有良好的反应原性,同时它们具有分泌进入包囊周围肝实质组织中的潜能,可能进一步参与细粒棘球蚴与宿主的相互作用。

鸡肠炎沙门菌毒力蛋白SipD生物信息学分析及原核表达

【目的】预测肠炎沙门菌(Salmonella Enteritidis, SE)SipD蛋白的潜在生物学功能,并表达纯化该蛋白,为探索SipD蛋白作为抗沙门菌纳米抗体的候选抗原提供理论依据。【方法】利用DNAStar软件对GenBank中公布的不同血清型沙门菌株SipD蛋白氨基酸序列进行相似性比对,并通过在线软件对SipD蛋白进行生物信息学分析。根据GenBank中SipD基因序列设计引物,以鸡肠炎沙门菌标准菌株(ATCC 13076)为模板,PCR扩增SipD基因,构建pET-32a(+)-SipD重组质粒,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。应用IPTG诱导重组SipD蛋白的表达,并利用Ni^(2+)亲和层析法纯化。应用SDS-PAGE和Western blotting检测SipD蛋白的表达情况。【结果】SipD蛋白在不同血清型沙门菌之间高度保守;SipD蛋白分子式为C_(1619)H_(2573)N_(441)O_(540)S_(8),无跨膜区,为膜外蛋白,不存在信号肽,该蛋白的第1~343位氨基酸具有来自超家族侵袭质粒抗原IpaD的保守结构域;SipD蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲占比分别为59.18%、6.41%、3.21%和31.20%;SipD蛋白与B细胞结合的抗原表位有12个。SipD基因长1 029 bp,在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中以可溶性蛋白的形式表达;经纯化、透析、浓缩后蛋白浓度为8.6 mg/mL。SDS-PAGE和Western blotting分析发现,SipD蛋白纯度较高,可用于免疫羊驼制备纳米抗体。【结论】SipD蛋白为膜外蛋白,具有较多抗原结合位点;经表达纯化得到纯度较高的SipD重组蛋白,为进一步制备靶向鸡肠炎沙门菌SipD蛋白的纳米抗体提供材料。

猪肠病毒G型部分VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

本研究扩增猪肠病毒G型(EV-G)的部分VP1基因,将其克隆至原核表达载体,并对其进行诱导表达,获得重组蛋白并制备多克隆抗体,通过酶联免疫吸附试验,免疫印迹试验和间接免疫荧光试验对其进行验证。结果表明,本研究制备的兔抗EV-G-VP1多克隆抗体具有良好的免疫原性和反应性,可以特异性识别EV-G感染Marc-145细胞表达的VP1蛋白,为猪肠病毒G型免疫学检测方法的建立提供良好的生物学材料。

A型流感病毒PB2蛋白帽子结合结构域的原核表达与鉴定

A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,严重威胁全球公共卫生安全。PB2蛋白的帽子结合结构域(CBD)在流感病毒的转录过程中发挥重要功能,是抗流感病毒药物的重要靶点之一。为获得高纯度原核表达的A型流感病毒的CBD蛋白,本研究利用同源重组策略将8×His标签与一株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的CBD区基因序列克隆至原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-8×His-CBD,经PCR及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经不同浓度IPTG诱导不同时间后,经SDS-PAGE检测蛋白表达后使用镍柱纯化。结果显示,菌体裂解上清中在21 ku处可见目的条带,与8×His-CBD蛋白预期大小符合,且以0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导6 h时蛋白表达量最高,镍柱纯化后可获得纯度大于95%的8×His-CBD蛋白。为确定该蛋白是否具有生物学活性,本研究以帽子结构类似物m7GTP对其进行等温滴定量热试验,结果显示8×His-CBD蛋白和m~7GTP结合时存在明显热峰,表明8×His-CBD蛋白具有生物学活性;经计算,其Kd值为1.71×10^(-5)(±2.92×10^(-6))mol/L。本研究结果对流感病毒的基础研究和抗流感病毒药物的研发具有借鉴意义。