球毛壳菌(Chaetomium globosum)过氧化物膜蛋白过敏原基因克隆、序列分析及原核表达

以球毛壳菌cDNA文库中获得过氧化物膜蛋白(pero)基因片段(GenBank Accn: BP099709)为基础,用RACE技术获得该基因的全长cDNA序列。序列长747bp,由412bp的3’ RACE产物和508bp的5’RACE产物拼接而成。开放阅读框501bp,编码166个氨基酸,蛋白分子量为17．5kDa,理论等电点为5．75。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA 序列,序列分析表明该基因由2个内含子和3个外显子组成。ClustalX多序列比对表明:该基因与粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的过氧化物膜蛋白过敏原同源性最高(83％)。将pero基因编码区克隆到原核表达载体pET28a中,构建成表达质粒pET28a-pero并转化大肠杆菌BL21,IPTG 诱导后SDS-PAGE检测表达情况,结果发现在21kDa处有一特异性融合蛋白带,大小与预期相符, 说明该基因已经在大肠杆菌中表达。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在 GenBank登录(登录号分别为AY555771,AY584753,AAS66898)。

茶树4-香豆酸辅酶A连接酶基因Cs4CL1的克隆与蛋白表达分析

4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)是木质素合成过程中的关键酶。本试验以‘福鼎大白’茶树为材料,克隆得到Cs4CL1基因,该基因长度为1715 bp,开放阅读框长度1623 bp,编码540个氨基酸。氨基酸同源性分析显示,Cs4CL1蛋白具有植物4CL酶的典型特征,即AMP结合功能域和GEICIRG保守区。系统进化分析显示,Cs4CL1蛋白与蓝果树、烟草、番茄等植物的4CL1蛋白聚为一类,属于4CL亚家族A。利用原核表达系统可诱导出具有活性的Cs4CL1重组蛋白,该蛋白大小为78 kD。本研究为深入解析Cs4CL1在茶树木质素合成途径中的功能奠定了基础。

薄荷柠檬烯-6-羟化酶基因(MhL60H)的克隆与表达分析

从薄荷(Mentha haplocalyx Briq.)叶cDNA中克隆到1个参与精油合成的柠檬烯-6-羟化酶基因,命名为MhL6OH,编码的蛋白质为MhL6OH。序列分析结果表明:该基因蛋白质编码区(CDS)全长1 479 bp,编码492个氨基酸残基;MhL6OH蛋白的理论相对分子质量为55 855.69,理论等电点为pI 8.71,其二级结构中α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角的比例分别为51.02%、30.49%、12.40%和6.10%,且该蛋白质含有保守的细胞色素P450结构域,说明薄荷MhL6OH蛋白属于CYP71家族的D亚家族。多重序列比对结果表明:薄荷MhL6OH蛋白与椒样薄荷(M.piperita Linn.)MpL6OH蛋白和留兰香(M.spicata Linn.)MsL6OH蛋白的氨基酸序列高度相似,均具有细胞色素P450的血红素结合区;并且,MhL6OH蛋白与MpL6OH蛋白底物识别位点(SRS)的序列相似性更高,二者的SRS2、SRS3、SRS5和SRS6序列完全相同,仅分别在SRS1和SRS4序列上存在1个氨基酸差异,说明MhL6OH蛋白与MpL6OH蛋白可能具有相似的底物识别特异性。系统进化树分析结果表明:薄荷与椒样薄荷的亲缘关系最近。组织表达特性分析结果显示:MhL6OH基因的相对表达量在薄荷叶中最高,并远高于其在茎和根中的相对表达量。原核表达分析结果显示:MhL6OH蛋白能够在大肠杆菌[Escherichia coli(Migula) Castellani et Chalmers]中高量表达,且其表达量随诱导时间延长而逐渐增大。研究结果显示:薄荷MhL6OH基因组织表达模式与其精油分布一致,MhL6OH蛋白底物识别位点的特异性可能是薄荷醇为薄荷精油主要成分的重要原因。

大肠杆菌glgC基因的定点突变及功能分析

利用PCR从Escherichia coli JM109基因组中扩增到全长为1296bp的glgC基因编码区,通过PCR重组方法进行点突变,获得氨基酸突变的3个突变体,分别是Pro295Ser(Val121Ala,Met151Ile和Val334Asp)、Gly336Asp单点突变和Pro295Ser/Gly336Asp(Lys109Arg),其基因分别命名为295+3、336和295/336+1。将突变和未突变的基因分别克隆到pET32-a,构建重组质粒pET-glgC、pET-295+3、pET-336和pET-295/336+1,在文中分别简称为a、b、c和d。转化大肠杆菌BL21(DE3),在1mmol/L IPTG诱导下表达。SDS-PAGE电泳分析显示,在约67kDa处有1条明显与预期大小一致的蛋白质,表明目的基因已得到融合表达。上述转化子的碘染和糖原含量测定结果,第336位的Gly变成Asp后,宿主菌的糖原含量提高;Pro295Ser/Gly336Asp(Lys109Arg)的突变导致宿主菌的糖原含量与Gly336Asp突变体相近,表明在336突变基因的基础上增加Pro295Ser的突变没有进一步加大宿主菌中AGPase酶的反馈抑制效应的降低。已有的结果显示,Pro295Ser可以降低AGPase酶的反馈抑制效应活性,而实验中295+3突变基因转入宿主菌后细胞糖原含量明显降低,推测这个结果可能是295+3中的Val334Asp的突变造成,而334位的氨基酸可能是AGPase功能域中的一个重要位点。

羊口疮病毒ORF019基因的克隆及表达

【目的】克隆、分析羊口疮病毒(ORFV)的ORF019基因,进而表达、纯化和鉴定重组表达产物.【方法】根据GenBank登录的ORFV OV-SA00株(AY386264)E2L基因序列设计1对引物,以提取的ORFV/QH02/2010株基因组DNA为模板,通过PCR获得该毒株的ORF019基因,将该基因连接至原核表达载体pET-32a(+)上,获得重组质粒pET-32a-ORF019,并对其测序,测序结果与副痘病毒属及其脊椎动物痘病毒亚科代表毒株的E2L蛋白进行一致性分析;并转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导获得重组融合蛋白,用SDS-PAGE和Western-blot对表达的目的蛋白进行分析.【结果】成功获得重组质粒pET-32a-ORF019,读码框正确;生物信息学分析发现,ORF019基因在副痘病毒属各成员间高度保守,也在脊椎动物痘病毒亚科痘病毒的遗传进化过程中保留了相对稳定的氨基酸残基;获得了约100 ku的融合蛋白表达产物,并以包涵体的形式存在于宿主菌.【结论】成功对ORFV019基因进行系统的遗传演化分析,并利用原核表达系统获得了重组表达产物.

甘蔗过氧化物酶基因ScPOD02的克隆与功能鉴定

过氧化物酶(POD)广泛存在于植物各种器官及其不同发育阶段,在植物生长发育及应对逆境胁迫中起重要作用。本研究基于前期转录组数据,从黑穗病菌侵染2 d的甘蔗抗黑穗病品种崖城05-179中分离到ScPOD02基因的cDNA(GenBank登录号为KU593507)及基因组DNA(GenBank登录号为KU593508)序列。其cDNA全长为1434 bp,ORF区为1047 bp,编码348个氨基酸,而基因组DNA全长为1558 bp,含2个外显子和1个内含子。系统发育树显示,ScPOD02与水稻Os Prx11(GenBank登录号为gi|55700889)属于同一个进化分支,推测ScPOD02属于酸性胞外分泌/细胞壁类型的I.1型过氧化物酶家族。将该基因克隆到原核表达载体p ET 32a上,转化大肠杆菌BL21,经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导成功获得了大小约60 k D的融合蛋白,且该重组菌在聚乙二醇胁迫下的长势较对照快,表明其耐受干旱胁迫的能力更强。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析表明,除ROC22和YZ03-103外,ScPOD02基因在甘蔗抗病品种(YZ03-258、YZ01-1413、YT96-86和LC05-136)中受黑穗病菌诱导上调表达,但在中感(GT02-467和FN39)和感病(FN40)品种中的基因表达量基本维持不变或略有降低;此外,ScPOD02积极应答水杨酸、脱落酸、聚乙二醇及氯化钠的胁迫。通过农杆菌介导法在本氏烟叶片上瞬时表达ScPOD02,结果显示出较深的DAB染色,且过表达后本氏烟中的目标基因(ScPOD02)及过敏性反应(HR)标记基因(Nt HSR201和Nt HSR203)和乙烯合成依赖基因(Nt EFE26和Nt Accdeaminase)均上调表达。以上研究结果显示,ScPOD02具有参与甘蔗免疫应答及抗旱和抗盐害的潜在功能。

茶树两个MYB转录因子基因的克隆及功能验证

第4亚组R2R3-MYB可能参与木质素合成的调控,从而影响植物的生长发育。本文利用RACE技术,克隆了两个茶树第4亚组MYB转录因子(CsMYB4-5和CsMYB4-6)。生物信息学分析发现CsMYB4-5氨基酸序列与金鱼草中的AmMYB330一致性为48.45%,与拟南芥中的AtMYB3一致性为44.79%;CsMYB4-6氨基酸序列与金鱼草中的AmMYB308一致性为69.80%,与拟南芥中的AtMYB4一致性为62.41%。实时荧光定量PCR分析表明两个基因均在根中高表达而在茎中低表达。原核表达分析表明,CsMYB4-5和CsMYB4-6的分子量分别为32 kD和27 kD左右。烟草转化实验表明,与野生型烟草相比较,转CsMYB4-6基因的烟草叶片的叶脉紧缩而脉间凹凸不平,老叶有白色斑点,而转CsMYB4-5基因的烟草老叶发黄。