幽门螺杆菌47kDa微孔蛋白基因的克隆表达及特性鉴定

目的对人幽门螺杆菌（H．pylori）编码47kDa外膜微孔蛋白基因omp47克隆表达及特性鉴定，探索研制H．pylori疫苗的新途径。方法培养和收集H．pylori标准菌株NTTCll637及临床菌株，采用酚：氯仿抽提、纯化基因组DNA。设计上下游引物，并以该基因组为模板，采用聚合酶链反应（PCR）扩增omp47基因片断。将目的基因和与克隆载体PGEM-T连接后，转化至EcoliDH5a及BL21，碱裂解提取质粒经BamHl和Xhol双酶切鉴定并进行序列分析。重组蛋白采用IPTG诱导表达后，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）鉴定、镍亲和层析纯化检测抗原活性。结果经酶切、测序分析表明，插入的基因片断为1284bp，编码427个氨基酸。与GenBank公布的H．pylori标准株26695、43504及J99序列比对，核苷酸同源性高达94%～96％，编码氨基酸同源性96%～99%。经SDS-PAGE检测，电泳图谱上显示一条相对分子量为47kda的新生蛋白带。Westernblot检测表明重组蛋白有较好的抗原性。结论成功克隆了外膜微孔蛋白OMP47的编码基因，为H．pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了良好的基础。