莱姆病螺旋体端粒解离酶的表达纯化及其晶体衍射分析

【目的】对莱姆病螺旋体(Borrelia burgdorferi)端粒解离酶(telomere resolvase,ResT)进行原核可溶性表达纯化,并筛选高衍射度的ResT-DNA复合物晶体,为探究ResT-DNA复合物的结构和功能奠定基础。【方法】合成pET28 b-ResT表达质粒,构建原核表达载体pSUMO-ResT,分析ResT可溶性蛋白在BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21 Gold(DE3)pLysS、BL21 Codon Plus(DE3)、Rosetta(DE3)和Rosetta(DE3)pLysS中的表达量,获得最优的ResT原核表达菌株。基于AlphaFold预测的ResT蛋白模型,利用定点突变及ResT可溶性蛋白表达分析,获得高效可溶性表达ResT突变体。经Ni-NTA亲和层析、HiTrap Heparin HP亲和层析及分子筛层析对ResT突变体ResT(W94H)进行蛋白纯化。利用EMAS检测ResT(W94H)与DNA的结合能力。使用蛋白晶体接种(seeding)和交叉接种(cross-seeding)方法,利用多种商业化结晶试剂盒筛选并优化ResT-DNA复合物的结晶条件,对复合物晶体进行X射线衍射分析。【结果】BL21 Gold(DE3)pLysS菌株是ResT最佳的高效可溶性表达菌株,W94H突变体比野生型具有更强的可溶性表达。获得了高纯度(95%)且高质量浓度(15 mg/mL)的ResT(W94H),其能够与底物DNA形成稳定的ResT-DNA复合物。在18℃下,ResT-DNA最佳结晶条件是:PEG3350150 g/L、二甲苯二酸钠0.1 mol/L(pH 6.6)、NaCl 0.15 mol/L,ResT-DNA晶体分辨率最高为3.52,晶体空间群为P4。【结论】得到了高纯度ResT(W94H)蛋白,获得了ResT-DNA复合物晶体。

附睾特异分泌蛋白Lipocalin13的原核表达和纯化及其与配体结合特性的分析

大鼠Lipocalin13(rLcn13)是最近发现的一个大鼠附睾特异分泌的lipocalin家族蛋白,与男性生殖密切相关。该工作分析了rLcn13的染色体定位和基因特征,用同源模建方法获得了rLcn13蛋白的三级结构,并构建了rLcn13蛋白的原核表达系统,对rLcn13蛋白进行了可溶表达和纯化,并研究了rLcn13蛋白的配体结合特性。结果表明:(1)rLcn13蛋白在原核表达系统中能实现可溶性表达,并具有良好的三级结构;(2)rLcn13蛋白的二级结构以β-折叠为主;(3)rLcn13蛋白具有较强的视黄酸结合能力,也能结合其它一些lipocalin蛋白的配体;(4)rLcn13蛋白在大鼠附睾中可能起着视黄酸结合和转运作用,并有可能参与免疫反应。该研究为rLcn13蛋白的三维结构解析及其生理功能以及其它lipocalin家族蛋白的结构与功能关系的研究奠定了基础。

人组氨酸磷酸酶PHP14的原核表达及其体外互作蛋白的研究

目的:表达和纯化人组氨酸磷酸酶PHP14蛋白,并寻找与其存在体外相互作用的蛋白。方法:PCR扩增PHP14的全长cDNA,并将其克隆至pGEX4T原核表达载体,构建重组表达质粒。用重组表达质粒转化大肠杆菌BL21菌株,经IPTG诱导后,使用Glutathione Sepharose 4B凝胶颗粒进行亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳确定融合蛋白的表达。进行GST-Pulldown实验,寻找体外与PHP14相互作用的蛋白,并进行质谱鉴定。结果:在大肠杆菌BL21中成功了表达出了PHP14的可溶性融合蛋白;经Glutathione Sepharose4B凝胶颗粒纯化后,获得了纯化的GST-PHP14融合蛋白,GST-Pulldown实验和质谱鉴定结果发现PHP14与HSP90在体外存在相互作用。结论:实现了PHP14的原核表达和纯化,发现PHP14与HSP90在体外可能存在相互作用。

小鼠RHOX5蛋白两种截短型突变体的原核表达及其与MDFIC互作的鉴定

目的:表达和纯化两种小鼠RHOX5蛋白的截短型突变体,确定完整的RHOX5蛋白及其两种截短型突变体与MDFIC蛋白结合的能力。方法:生物信息学分析小鼠同源异型框蛋白RHOX5的cDNA序列,分别对RHOX5的两种截短型片段RHOX5 N和RHOX5 C进行PCR、分别扩增RHOX5的两种截短型片段RHOX5 N和RHOX5 C并将其克隆至pGEX4T3原核表达载体,构建重组表达质粒。用重组表达质粒分别转化大肠杆菌RosettaTM2(DE3)菌株,经IPTG诱导后,使用Glutathione-Sepherase 4B颗粒对融合蛋白进行小批量亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳分离目标蛋白,确定融合蛋白的表达。进行GST-pull down实验,检测完整的RHOX5蛋白及其两种截短型突变体与MDFIC蛋白结合的能力。结果:在大肠杆菌RosettaTM2(DE3)中有效地实现了GST-RHOX5、GST-RHOX5 N和GST-RHOX5 C 3种融合蛋白的可溶性表达;经Glutathione Sepherase 4B颗粒亲和纯化后,获得了纯化后GST融合蛋白;GST-pull down实验证实,含有homeodomain的RHOX5蛋白和RHOX5C截短型突变体可以与MDFIC蛋白相结合,而RHOX5N截短型突变体则丧失了与MDFIC蛋白结合的能力。结论:实现了RHOX5及其两种截短型突变体的原核表达和纯化,证实RHOX5蛋白的homeodomain结构域是其与MDFIC结合的关键部位。

ΦC31位点特异性整合酶DNA结合功能域的鉴定

DNA结合功能域的确定是阐明位点特异性重组酶整合机制的关键,而对酶DNA结合功能域进行突变研究是提高酶整合效率和整合特异性的重要方法.为了鉴定ΦC31位点特异性整合酶的DNA结合功能域,依据对ΦC31整合酶序列的生物信息学分析结果,利用PCR和克隆技术在pET22b原核表达载体上构建ΦC31整合酶重组截短突变体表达质粒,将获得的表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株扩大培养并用IPTG诱导融合蛋白的表达,经镍柱纯化获得了纯度达90%以上的重组蛋白,分子量也与预期大小一致,Western印迹确定了重组蛋白的特异性.凝胶迁移滞后实验显示野生型以及截短突变体蛋白ΦC311-528、ΦC311-472、ΦC311-413能与细菌附着位点DNAattB和噬菌体附着位点DNAattP结合的条带,而截短突变体ΦC311-353、ΦC311-279、ΦC311-120观察不到相应的结合条带.6个截短突变体质粒在体内重组活性蓝白斑实验中均表现为蓝斑,显示出皆丧失体内重组活性.研究证实,ΦC31整合酶半胱氨酸富集域(第353～413位氨基酸)具有DNA结合的功能,而C末端缬氨酸富集区(第528～613位氨基酸)也与其重组活性相关.这为进一步了解ΦC31整合酶的结构与功能,最终引导其结构进化,提高其特异性和整合效率奠定了基础.

T20N点突变对水稻OsRacD蛋白GTP酶活性的影响

OsRacD是水稻小GTP结合蛋白Rho家族成员,其功能之一是作为"分子开关",通过控制花粉管的延伸生长,参与光敏核不育水稻光周期的育性转换。在序列同源性比对和蛋白保守结构域分析的基础上,采用重叠延伸PCR方法在水稻OsRacD基因的第一个高度保守的基序G1区引入T20N点突变,模拟GDP结合形式的OsRacD。进一步构建了与组氨酸标签融合的原核表达载体,原核表达和纯化了野生型和突变型OsRacD蛋白,并通过Western blot证实了融合蛋白表达和纯化的正确性。纯化蛋白的GTP酶活性检测结果显示,突变后的OsRacD蛋白GTP水解活性显著降低,提示OsRacD在T20N突变前后具有不同的生化特性。