犬瘟热病毒N蛋白基因融合蛋白原核表达条件的优化与蛋白纯化

【目的】提高犬瘟热病毒N蛋白基因在大肠杆菌中表达可溶性GST融合蛋白的含量。【方法】研究诱导剂(IPTG)的最佳加入时间、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间以及不同温度条件对GST-CDV N融合蛋白表达的影响,获得在大肠杆菌中的最佳的表达条件,然后再在最佳条件下大量的表达,用GST-Sepharose 4B亲和层析柱对GST-CDV N融合蛋白进行纯化,得到最大量的可溶性融合蛋白,并对蛋白含量进行测定。【结果】大肠杆菌BL21(DE3)转化菌在37℃培养3.5 h(OD600=1.314)时,加入IPTG使终浓度为1 mmol/L,然后在27℃诱导8 h,GST-CDV N融合蛋白可溶性表达量最高,达到0.862 mg/mL。【结论】确定了犬瘟热病毒N蛋白基因的优化表达条件,为犬瘟热病毒分子免疫学诊断和亚单位疫苗的研制奠定了基础。

拟除虫菊酯类农药降解酯酶EstA融合蛋白表达质粒的构建和诱导条件优化

以前期克隆得到的拟除虫菊酯类农药降解基因estA(GenBank:DQ906143)为出发基因,构建表达系统,获得可溶性融合蛋白,并通过优化诱导表达条件,获得具有实际应用价值的相关应用参数。结果表明,成功构建了重组表达载体pMal-c2X-estA并转化至宿主菌BL21(DE3),获得酯酶estA基因诱导表达系统;通过SDS-PAGE凝胶电泳、以α-乙酸萘酯为底物的酶活性检测及Western blot方法,确认外源蛋白EstA在大肠杆菌宿主菌中成功表达并具有酯酶活性。重组基因工程菌可溶性原核表达诱导条件的优化试验表明,其最佳诱导表达条件是:Ca2+浓度1.0mmol/L、诱导初始OD600值0.7、诱导剂IPTG浓度0.1mmol/L、诱导初始pH值7、诱导温度26℃、诱导时间17.5h,优化后的酯酶活性(92.03U/mg)较优化前(44.64U/mg)提高了1倍多。