猪和小鼠endoglin原核表达载体的构建及重组蛋白的诱导表达和纯化

目的:体外扩增猪和小鼠endoglin胞外段基因序列,构建猪和小鼠endoglin重组原核表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达,并对表达产物进行分离、纯化和鉴定。方法:设计猪和小鼠endoglin胞外段基因序列的引物,利用RT-PCR技术扩增克隆猪和小鼠endoglin胞外段基因序列,通过限制性核酸内切酶酶切,然后用T7酶连接,构建猪和小鼠endoglin胞外段的原核表达质粒pQE-pEDG和pQE-mEDG。筛选的重组质粒经酶切和DNA序列测定等证实正确后,再转染感受态大肠杆菌JM109,用IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA亲合层析进行分离纯化,最后用SDS-PAGE和免疫印迹法进行鉴定。结果:琼脂糖凝胶电泳发现扩增克隆的猪和小鼠endoglin胞外段基因序列分子量大小和预期值相一致,酶切分析显示,pQE-pEDG和pQE-mEDG和预期值相符,DNA序列测定显示,目的基因片段和阅读框架正确无误。重组蛋白质在大肠杆菌中获得稳定表达,表达的重组蛋白分子量与预期值相一致,纯化的蛋白浓度达90%以上,抗小鼠endoglin抗体可特异性识别pEDG和mEDG。结论:成功构建了猪和小鼠endoglin的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达并纯化,为进一步了解重组endoglin蛋白质作为疫苗是否可以有效诱导产生抗自身endoglin的免疫反应奠定了基础。

人幽门螺杆菌尿素酶B编码基因的克隆及序列分析

目的 获取含人幽门螺杆菌 (Hp)尿素酶B编码基因并构建其原核表达的重组载体 ,进行核甘酸序列分析 ,为在E .coliBL2 1中表达 ,疫苗的开发奠定基础。方法 利用分子克隆技术从HpDNA染色体中 ,扩增尿素酶B编码基因片段。将目的基因与pET32a(+)同时经SacI、Xhol双酶切、纯化、连接后 ,转化含有目的基因的重组载体 ,进行序列分析。结果 经酶切、测序分析表明 ,插入的基因片段为Hp尿素酶B编码基因 ,与GenBank公布的序列相比较 ,有 1.8%的bp发生变异 ,0 .35 %的氨基酸残基改变 ,但同源性高达 98%。结论 成功地克隆了Hp尿素酶B编码基因 。