牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白p7 的克隆和原核表达纯化

为了对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)p7蛋白进行表达和纯化,本研究开展p7基因克隆、原核表达载体构建和原核表达分析。依据GenBank数据库中BVDV毒株NADL的p7基因设计引物,以BVDV NADL的cDNA为模版,PCR扩增p7基因,测序鉴定后将其克隆至pCold-MBP原核表达载体中;优化蛋白诱导的IPTG浓度,过夜低温诱导p7蛋白表达,并使用Ni-TED琼脂糖树脂进行蛋白纯化。结果显示,成功克隆p7基因,与GenBank数据库中p7基因同源性100%;成功构建pCold-MBP-p7载体;IPTG浓度为1.2mM时诱导效果最佳;成功表达和纯化MBP-p7融合蛋白。结论:诱导表达纯化获得MBP-p7融合蛋白,为后续构建p7蛋白的多克隆和单克隆抗体提供重要的材料和平台。

牛RECQL解旋酶的原核表达纯化及解旋条件优化

【目的】通过大肠杆菌表达纯化牛(Bos taurus)RECQL蛋白,利用停流光谱技术对解旋条件进行优化,为研究RECQL的酶促反应动力过程奠定基础。【方法】将人工合成的牛RECQL蛋白编码序列与pET21a载体相连接,获得重组表达载体pET21a-BtRecql后,将其导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达,经过Ni-NTA亲和层析和Superdex 200凝胶过滤层析,得到纯化的重组蛋白BtRECQL;再利用停流光谱技术对BtRECQL解旋过程进行检测分析,通过摸索不同的试验参数找到BtRECQL发挥解旋功能较适宜的条件。【结果】得到了纯度大于95%的BtRECQL蛋白,产量为0.29 mg/L。在BtRECQL浓度为60nmol/L,反应条件为1.0 mmol/L ATP,30mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,60mmol/L NaCl,1mmol/L MgCl2,2mmol/L DTT,孵育温度为37℃时,该蛋白解旋活性较好。【结论】成功表达并纯化了BtRECQL蛋白,确定了其最优的解旋条件。

莱姆病螺旋体端粒解离酶的表达纯化及其晶体衍射分析

【目的】对莱姆病螺旋体(Borrelia burgdorferi)端粒解离酶(telomere resolvase,ResT)进行原核可溶性表达纯化,并筛选高衍射度的ResT-DNA复合物晶体,为探究ResT-DNA复合物的结构和功能奠定基础。【方法】合成pET28 b-ResT表达质粒,构建原核表达载体pSUMO-ResT,分析ResT可溶性蛋白在BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21 Gold(DE3)pLysS、BL21 Codon Plus(DE3)、Rosetta(DE3)和Rosetta(DE3)pLysS中的表达量,获得最优的ResT原核表达菌株。基于AlphaFold预测的ResT蛋白模型,利用定点突变及ResT可溶性蛋白表达分析,获得高效可溶性表达ResT突变体。经Ni-NTA亲和层析、HiTrap Heparin HP亲和层析及分子筛层析对ResT突变体ResT(W94H)进行蛋白纯化。利用EMAS检测ResT(W94H)与DNA的结合能力。使用蛋白晶体接种(seeding)和交叉接种(cross-seeding)方法,利用多种商业化结晶试剂盒筛选并优化ResT-DNA复合物的结晶条件,对复合物晶体进行X射线衍射分析。【结果】BL21 Gold(DE3)pLysS菌株是ResT最佳的高效可溶性表达菌株,W94H突变体比野生型具有更强的可溶性表达。获得了高纯度(95%)且高质量浓度(15 mg/mL)的ResT(W94H),其能够与底物DNA形成稳定的ResT-DNA复合物。在18℃下,ResT-DNA最佳结晶条件是:PEG3350150 g/L、二甲苯二酸钠0.1 mol/L(pH 6.6)、NaCl 0.15 mol/L,ResT-DNA晶体分辨率最高为3.52,晶体空间群为P4。【结论】得到了高纯度ResT(W94H)蛋白,获得了ResT-DNA复合物晶体。

人Neuritin在原核表达系统的构建及表达纯化

Neuritin是一种新发现能促进神经突起和轴突分支的蛋白,为了更清楚的研究它的生物学功能,在已克隆Neuritin cDNA的基础上,PCR扩增出Neuritin ORF,与原核表达载体pET32a重组后,成功的构建了Neuritin原核表达质粒pET32a-Neuritin。重组质粒转化B121大肠杆菌,IPTG 诱导后,表达产物用SDS-PAGE和Western blot证实系Neuritin,用镍离子亲和层析的方法获得了纯化的Neuritin蛋白。

重组可溶性人IL-6的原核表达纯化和活性鉴定

使用大肠杆菌BL21(DE3)重组表达可溶性人IL-6并对其进行纯化和活性鉴定。以人激活T细胞总RNA为模板,逆转录PCR扩增人IL-6的基因片段并将其克隆到原核表达载体pET32a(+)中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),优化表达条件获得可溶性表达目的蛋白。细菌裂解上清经镍金属螯和层析纯化,SDS-PAGE鉴定其分子量大小,western blot鉴定其免疫原性,并通过IL-6依赖的细胞株T1165分析重组蛋白的活性。成功构建了pET32a(+)/IL-6表达载体,并获得了可溶性表达的重组人IL-6蛋白。SDS-PAGE显示,其分子量约为21kD,可被抗IL-6抗体特异性识别,并且该重组蛋白可刺激IL-6依赖的细胞株T1165增殖,比活性与标准品一致,约为1×106 U/mg。本实验获得了可溶性高表达的重组人IL-6蛋白,为进一步研究人IL-6奠定了基础。

李斯特细菌hlyA的原核表达与纯化

目的构建李斯特细菌毒力基因原核表达质粒,并诱导其表达纯化并鉴定目的蛋白。方法构建李斯特溶血素O(Listeriolysin O,LLO)的原核表达载体PGEX/3X,并利用Factor Xa切割了GST标签,酶切正确后构建重组原核表达质粒,并转化到大肠杆菌,IPTG诱导目的蛋白表达并进行Western blot鉴定。结果目的基因经酶切其结果与预期相符,测序结果显示目的基因GenBank登陆的序列完全一致,重组质粒经IPTG诱导表达相对分子量为60 kD的目的蛋白;Western blot鉴定结果显示,重组蛋白能够与抗LM抗体特异性结合。结论成功构建了重组原核表达质粒,并纯化获得高纯度的LLO蛋白。

VIM-2型金属β内酰胺酶的序列分析、原核表达及纯化

目的对铜绿假单胞菌所产blaVIM-2进行基因重组表达及纯化。方法以产blaVIM-2铜绿假单胞菌总基因组DNA为模板,PCR扩增blaVIM-2,将其克隆入pUCm-T载体后测定该核苷酸序列,再将blaVIM-2克隆入表达载体pET-41b(+),然后在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,表达产物再过Ni-NTA柱纯化。结果PCR扩增出大小为801bp的基因片段,与GenBank上同类酶的基因序列同源性为100%。此基因能在大肠埃希菌中大量表达,蛋白分子质量大约为56000u。结论对VIM-2金属酶的成功表达及纯化为进一步做酶动力学及酶的其他分子生物学特性研究奠定了基础。

拟南芥FT基因原核表达载体的构建、表达和蛋白纯化

FT基因是植物成花素,在植物的开花调控中起着重要作用。构建了用于原核表达的FT-eGFP表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行重组蛋白的诱导表达。从IPTG诱导浓度、诱导时间和诱导温度等方面进行了细致的分析,最终建立了FT-eGFP融合蛋白诱导表达的优化体系:当菌液OD600=0.6-1.0时,采用IPTG1.0mol/L,在28℃诱导表达6h。摸索和建立了利用HisTrapKit标签,经过镍柱纯化,纯化目的蛋白的技术体系,为进一步研究FT基因在植物开花调控中的应用奠定了基础。

桃果实中脱落酸受体ABAR/CHLH结合区蛋白的原核表达、纯化及复性

为了剖析桃果实中脱落酸受体ABAR/CHLH蛋白的结合活性,从桃果实中提取总RNA,采用RT-PCR方法,以桃果实RNA逆转录的cDNA为模板,扩增出ABAR/CHLH基因的结合区功能片段C369,回收目的片段并测序,基因片段长度为1 121 bp,编码369个氨基酸残基,分子量约为40 kD。利用BamHⅠ和NotI酶切位点将该片段编码区插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建ABAR/CHLH基因片段原核表达载体pET28a-C369,经菌落PCR和测序确证后,转化E.coliRosetta(DE3),通过IPTG诱导其表达His-CHLH融合蛋白。通过SDS-PAGE检测及Ni-NTA琼脂糖树脂亲和层析柱纯化目的蛋白,并用纯化复性的His-CHLH C369融合蛋白制备抗体。

人白介素24基因克隆表达、纯化及活性检测

目的克隆人IL-24基因,构建原核表达载体,表达纯化GST-IL-24融合蛋白,检测其活性。方法用密执毒素诱导HeLa细胞表达IL-24 mRNA,通过RT-PCR获取IL-24cDNA,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,IPTG诱导表达,经GSTrap TMF Fcolumn亲合纯化,SDS-PAGE和Westernblot检测融合蛋白的表达,MTT法检测GST-IL-24对宫颈癌CaSKi细胞的抑制作用。结果克隆得到人IL-24的cDNA,序列与GenBank公布序列完全一致,SDS-PAGE电泳可见50kD大小的融合蛋白表达。GST-IL-24以剂量依赖的方式抑制宫颈癌CasKi细胞的生长。结论成功构建人IL-24基因原核表达载体,表达纯化得到GST-IL-24,该融合蛋白对宫颈癌CasKi细胞具有抑制作用。

淋病奈瑟菌磷脂酶A的生物信息学分析及其原核表达与纯化

目的:对淋病奈瑟菌磷脂酶A蛋白进行生物信息学分析并预测其免疫原性,用原核系统表达并纯化该蛋白。方法:利用生物信息学相关软件进行序列分析以及T细胞表位和B细胞表位预测。PCR扩增磷脂酶A基因,将目的基因连接到原核表达载体pET28a中,并在宿主菌Rosetta(DE3)中IPTG诱导表达,SDS-PAGE及Western印迹检测表达情况,并用淋病奈瑟菌多克隆抗体检测其免疫反应性。结果:磷脂酶A蛋白中位于第12~26和236~250肽段是最佳优势T细胞表位,第281~296、331~346和354~369肽段是最佳的优势B细胞表位。成功构建了含有磷脂酶A基因的pET28a重组质粒,并在宿主菌中得到了表达和纯化,Western印迹的结果显示该重组蛋白与特异性免疫血清能具有良好的免疫反应性。结论:预测结果以及重组蛋白的成功制备,为其作为淋病奈瑟菌表位疫苗和分子诊断技术的开发研究提供了基础和参考。

一种靶向性阳离子多肽载体的表达纯化

目的:原核表达靶向性阳离子多肽(KH)20-EGF,并对其DNA包装能力进行检验。方法:构建pET28a-(KH)20-EGF原核表达载体。进行酶切和测序鉴定。转化BL21(DE3)后,经过IPTG诱导表达和NTA树脂纯化得到粗提蛋白产物,SDS-PAGE和Western blot鉴定后,将蛋白与质粒DNA混合,用于凝胶阻滞实验分析。结果:重组(KH)20-EGF的产量约为300μg/L。SDS-PAGE和Western blot表明该蛋白的凝胶迁移有些滞后;凝胶阻滞试验发现(KH)20-EGF对质粒DNA的迁移有阻滞作用。结论:成功表达非病毒载体(KH)-EGF并确认其DNA包装能力。

镁螯合酶CHLI和CHLD亚基的表达纯化及其稳定复合体的鉴定

为明确植物光合作用中镁离子螯合酶CHLI与CHLD亚基形成复合物CHLI-CHLD这一重要过程的机制,首先需要获得可溶性CHLI和CHLD蛋白并确定其复合体装配。通过分子克隆技术构建截断的CHLI和CHLD重组体表达质粒。将其分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。通过Ni琼脂糖树脂(Ni sepharose 6 Fast Flow)和谷胱甘肽琼脂糖树脂(Glutathionsepharose 4 Fast Flow)亲和层析纯化可溶性重组蛋白。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和TEV酶切试验验证目标蛋白。采用GST-Pulldown试验鉴定CHLI与CHLD的相互作用。通过凝胶过滤层析和SDSPAGE测定复合体中CHLI与CHLD蛋白的比例。结果表明:成功构建了截断的CHLI和CHLD重组体表达质粒p ET-28a-CHLI(13-357),p ET-28a-CHLD(20-676)及p GEX-4T-2-CHLD(20-767);在18℃,0.2mmol·L-1 IPTG条件下诱导16h后,成功获得了可溶性的CHLI(13-357),CHLD(20-676)和GST-CHLD(20-676)重组表达蛋白;CHLI与CHLD存在直接相互作用且需要Mg2+和ATP;稳定复合体CHLI-CHLD的亚基比例为1∶1。综上表明原核表达及纯化镁离子螯合酶CHLI与CHLD亚基蛋白,在Mg2+和ATP存在的条件下通过凝胶过滤层析可获得1∶1的稳定复合体CHLI-CHLD。

花生类受体蛋白激酶AhAlSRK的原核表达与体外活性分析

基于对已有转录组数据的分析,发现花生AhAlSRK(LOC107458489)基因在耐铝花生品种99-1507和铝敏感型花生品种中花2号(ZH 2号)受铝毒害后基因表达量出现明显差异,暗示其可能参与花生铝胁迫下信号传递铝胁迫响应机制。花生AhAlSRK基因与拟南芥富含亮氨酸类受体蛋白激酶(leucine-rich repeat receptor-like kinases,LRR-RLKs)VIII_2亚家族中的AT1G56140基因具有相似的结构,为同源基因。为验证花生AhAlSRK蛋白激酶活性,克隆了AhAlSRK的全长编码序列,并基于对AhAlSRK蛋白结构预测的基础上,克隆了AhAlSRK的胞内域,构建其原核表达载体pGEX-6p-1-AhAlSRK-CD,转入大肠杆菌菌株Rosetta 2(DE3)plysS。在1 mmol/L IPTG条件下,16℃低温诱导过夜,成功诱导可溶性GST-AhAlSRK-CD蛋白。重组蛋白GST-AhAlSRK-CD表达效率较高,经过自磷酸化检测验证其具有丝/苏氨酸和酪氨酸激酶活性。实验结果为后续在蛋白质水平上探究AhAlSRK基因响应铝胁迫机理打下基础。

白脂素包涵体表达纯化及其功能评价

目的构建白脂素的原核表达质粒,表达及纯化重组白脂素蛋白,并初步探索其功能,为进一步研究白脂素作用机制及其生理病理作用提供依据。方法利用基因工程技术构建表达白脂素BL21菌株,经异丙基硫代半乳糖苷诱导,梯度尿素复性,亲和层析纯化及去内毒素处理得到可用于细胞和动物实验的重组白脂素。采用血糖仪检测重组白脂素腹腔注射后C57小鼠血糖变化情况。Alamar Blue检测重组白脂素作用24 h对MIHA细胞活性的影响;重组白脂素刺激MIHA细胞24 h,用蒽酮法检测糖原含量。结果在37℃,A600 nm=0.8,IPTG终浓度为1 mmol/L诱导4 h目的蛋白表达效果较好。通过纯化和去内毒素处理,重组白脂素纯度大于95%,内毒素含量小于1 EU/mg,可以用于动物与细胞实验。腹腔注射重组白脂素60 min后C57小鼠血糖升高至峰值(重组白脂素组vs对照组P=0.021),120 min恢复到正常水平(重组白脂素组vs对照组P=0.03)。重组白脂素刺激MIHA细胞24 h,对细胞活性没有影响;检测糖原发现,不同浓度白脂素组糖原与对照组比较差异有统计学意义(P1=0.013,P2=0.036,P3=0.011)。结论通过原核表达系统成功表达及纯化了白脂素蛋白,该方法纯化后的白脂素具有降低MIHA细胞糖原含量及升高小鼠血糖的作用,这为白脂素功能的进一步研究提供了理论依据。

酿酒酵母RAVE复合物的155kD亚基Rav1p的克隆及其在大肠杆菌中的表达纯化

以酿酒酵母基因组DNA为模板，根据GenBank上公布的酿酒酵母Rav1p基因（ray1）序列和表达载体特性设计特异性引物，PCR扩增得到4074bp的DNA片段，将PCR产物和原核表达载体pET28a（＋）同时进行双酶切；双酶切后的PCR产物和表达载体进行连接，构建成重组质粒pET28a．rav1。再将pET28a．rav1转化到BL21（DE3）感受态细胞中。经IPTG16℃低温诱导40h表达His-tag融合的Rav1p。诱导后的菌体进行超声波破碎，然后用GEheahhcare公司的AKTA蛋白纯化仪和HisTrapHP1mL亲和层析柱纯化目的蛋白。SDS—PAGE电泳分析和Westernblot分析显示在155kD有明显的条带，成功实现了Rav1p在大肠杆菌中的表达纯化。

玉米大斑病菌细胞周期蛋白依赖性激酶结构亚基StCks1鉴定及其基因功能分析

【目的】Cks1(cyclin-dependent kinase subunit 1)是细胞周期蛋白依赖性激酶复合体CDK(cyclin-dependent kinase)的结构亚基,是细胞周期调控过程中的关键基因。论文旨在鉴定玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)StCks1,分析玉米大斑病菌附着胞发育过程中StCks1表达量差异及其互作蛋白,为进一步研究StCks1在附着胞发育中的作用打下基础。【方法】通过对玉米大斑病菌野生型菌株01-23全基因组数据分析,获取StCks1蛋白序列;利用软件MEGA 5.0和在线数据库Pfam、SMART对酿酒酵母、裂殖酵母和拟南芥等物种Cks1蛋白进行系统发育树构建和保守结构域分析;收集玉米大斑病菌附着胞发育不同时期样品进行转录组测序以及表达量分析。利用原核诱导表达系统,构建原核表达载体pGEX-6p-3-StCks1,并转化大肠杆菌表达菌株BL21,对重组蛋白GST-StCks1诱导表达纯化;通过GST pull-down、Western blot技术和酵母双杂交试验,鉴定StCks1的互作蛋白。【结果】玉米大斑病菌全基因组中鉴定到唯一StCks1蛋白编码基因,该蛋白由130个氨基酸组成;其三级结构主要由4股β折叠和3个α螺旋构成,含有HxPEPH(His-anyPro-Glu-Pro-His)保守位点和Cks保守结构域;通过转录组测序和表达量分析发现,StCks1在附着胞发育不同时期表达量显著上调;重组蛋白GST-StCks1在1 mmol·L^(-1) IPTG,30℃诱导2 h可获得大量可溶性蛋白;通过GST pull-down技术获取大量互作蛋白并进行质谱鉴定,通过Western blot和酵母双杂交试验,验证StCks1与细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1存在互作。【结论】玉米大斑病菌中含有唯一的StCks1,通过与细胞周期蛋白依赖性激酶CDK1互作调控附着胞的发育。

水稻OsC2HC-1锌指蛋白基因的表达分析及对盐碱逆境的响应

迄今,已从水稻中发现多种参与非生物胁迫反应的锌指蛋白基因,多为C2H2型,对于水稻C2HC型锌指蛋白基因的研究少有报道。本研究用RT-PCR技术从日本晴cDNA中克隆已知基因(AK103785)全长1019bp,编码339个氨基酸。经BLAST比对,确定其含有一个C2HC型锌指结构域,命名为OsC2HC-1,将OsC2HC-1::GFP融合导入酵母细胞和洋葱表皮细胞,亚细胞定位表明OsC2HC-1在细胞核中。实时荧光定量PCR检测80mmol/LNaCl,30mmol/LNaHCO3胁迫处理水稻叶和根中OsC2HC-1基因转录表达受其诱导显著增加。小量诱导优化pGEX-6p-3::OsC2HC-1在宿主菌BL21(DE3)中原核蛋白表达条件,表明诱导时间4h,28℃为最优条件,融合蛋白大量诱导纯化得到以包涵体的形式稳定存在,约为63kD的融合蛋白,为抗体的制作准备了条件。35S启动下过表达OsC2HC-1::GFP基因拟南芥萌发后期抗性分析实验表明,在125mmol/LNaCl,1mmol/LNaHCO3,3mmol/LNaHCO3胁迫下,过表达OsC2HC-1::GFP的拟南芥比野生型优势生长,表现出较强的盐碱抗性和抗氧化性,说明OsC2HC-1基因与抗盐碱性及抗氧化性有关。

多表位丙型肝炎病毒抗原的表达和分析

目的目前常用的丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)血清学检测试剂都基于3~6个重组蛋白或合成多肽,抗原制备繁琐且诊断效果参差不齐。制备一种诊断效能优良的HCV抗原势在必行。方法利用原核表达系统和层析纯化技术制备涵盖我国HCV主要流行株(1b和2a)的6个免疫显性区域的多表位HCV抗原(命名为H65),并以此建立HCV-IgG的血清学检测方法,通过对部分HCV阴阳性血清的检测,初步评价了H65抗原的免疫活性。结果融合Trx标签的H65抗原为可溶性形式表达,纯化后蛋白浓度可达2.991mg/ml,纯度为94.53%;Western blot法检测实验初步证实了蛋白H65的抗原性;应用某商品化试剂盒与H65抗原血清检测方法,对50份HCV阴阳性血清进行检测,McNemer检验显示,新制备诊断抗原与“金标准”比较,P>0.05,Kappa>0.75,且与某商品化试剂盒比较,P>0.05,Kappa>0.75,提示一致性优异。结论H65具有良好的免疫活性,为进一步应用多表位HCV抗原为基础的HCV-IgG体外诊断试剂提供了依据。

鸡WDR72基因的克隆表达及其相应抗体的制备

WDR72是课题组前期初步鉴定的蛋壳强度相关基因,它是个新基因。本文首先参考GenBank中原鸡(G.gallus)的WDR72基因序列设计3对引物,从仙居鸡子宫组织的cDNA中克隆WDR72基因,并构建家鸡WDR72编码基因的pEGFP-N1真核表达重组质粒;其次,将所克隆的WDR72基因的3′端编码序列构建到原核表达质粒pET-28b,然后利用0.4mmol/L的IPTG于37℃诱导表达WDR72的C端肽链;最后利用500mmol/L的咪唑纯化该肽链,并免疫大白兔制备wdr72特异性多抗。上述工作将为深入研究WDR72基因的生物学特性及其生化功能提供基础。