重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1的构建及表达

目的:构建人肿瘤相关抗原MAGE1基因原核表达载体。方法:从人肝细胞性肝癌组织中提取总RNA,RT- PCR扩增出MAGE1基因。酶切鉴定后,将其插入pGEM T载体,再克隆至原核表达载体pGEX4T-1中,构建重组表达质粒pGEX4T-1MAGE-1。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经1mmol/L异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4h,SDS PAGE及凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况。结果:RT-PCR扩增出长度为927bp的MAGE1基因。重组表达质粒pGEX4T1MAGE1转化大肠杆菌BL21(DE3)后经诱导表达,目的蛋白约57000,占菌体总蛋白的23%。结论:成功构建出重组原核表达载体pGEX4T-1MAGE-1,该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达。

原核质粒pGEX-4T-2-PLEKHQ1及真核质粒pCMV-Myc-PLEKHQ1的构建与蛋白表达

目的:构建基因PLEKHQ1的原核质粒及真核质粒。方法:全长编码基因PLEKHQ1的聚合酶链反应(PCR)产物经Eco RⅠ和Kpn1双酶切后,分别与双酶切后的载体pGEX-4T-2及载体pCMV-Myc相连,在pGEX-4T-2-PLEKHQ1转化E.coli DH5α提取质粒后,转化E.coli BL21中诱导GST-Q1融合蛋白表达,利用谷胱甘肽琼脂糖4B纯化诱导的融合蛋白;而pCMVMyc-PLEKHQ1则瞬转至293TX细胞;用蛋白质印迹法(Western blot)检测GST-Q1和Myc-Q1融合蛋白表达。结果:将获得的重组质粒进行双酶切鉴定,得到约1500 bp的目的片段,符合预计大小。质粒经测序分析正确后,Western blot检测到诱导及纯化后的GST-Q1和转染293TX后的Myc-Q1蛋白。结论:成功构建的pGEX-4T-2-PLEKHQ1和pCMV-Myc-PLEKHQ1重组质粒,为深入研究PLEKHQ1功能奠定良好的基础。

构建原核表达质粒pGEX-4T-2-GFP并鉴定其在大肠杆菌中的表达

目的:构建绿色荧光蛋白(GFP)的原核表达质粒,用以研究小鼠巨噬细胞吞噬细菌的能力。方法:编码GFP的聚合酶链反应(PCR)产物经Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切后,与双酶切后的载体p GEX-4T-2相连,将p GEX-4T-2-GFP转化E.coli DH5α提取质粒,经测序后转化E.coli BL21中诱导GST-GFP融合蛋白表达,将表达融合蛋白的大肠杆菌滴入培养巨噬细胞的皿中,于荧光显微镜下观察GFP的表达及大肠杆菌被吞噬情况。结果:获得的重组质粒测序正确。荧光显微镜下能清晰观察到培养基中及被巨噬细胞吞噬后发绿色荧光的大肠杆菌。结论:成功构建了pGEX-4T-2-GFP重组质粒,为研究小鼠巨噬细胞吞噬细菌的能力创造条件。

犬新孢子虫NcSRS2基因原核表达质粒的构建

根据已发表的犬新孢子虫NcSRS2基因序列,设计1对含有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点的引物。以提取犬新孢子虫虫体基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得NcSRS2 ORF基因片段,将此基因片段克隆到pMD18-T Simple载体上,用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切该片段,回收得到含有两个酶切位点黏端的Nc-SRS2 ORF基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM-4T-2原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-NcSRS2,经PCR鉴定,限制性内切酶分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。

人TIMP-2基因的克隆及其原核表达

目的构建人TIMP-2重组表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。方法提取人肝癌细胞(Hep G2)总RNA后,经RT-PCR扩增获得目的片段,插入克隆载体pMD18-T;酶切鉴定和测序后将TIMP-2导入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-TIMP-2。将重组质粒转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,IPTG诱导融合蛋白表达后用SDS-PAGE电泳检测并用western blot验证(蛋白质印迹法)。结果成功构建原核重组表达载体pGEX-TIMP-2,并在原核宿主BL21中大量表达融合蛋白GST-TIMP-2。结论克隆人TIMP-2基因并在原核生物中大量表达。

烟草C4H2基因的克隆与表达特性分析

以中烟202无菌幼苗为供试材料克隆出C4H2基因的CDS区,对该基因进行生物信息学分析,构建原核表达载体,在大肠杆菌中对重组质粒进行诱导表达及纯化分析,考查其在不同组织中的表达特性,以及叶片中黄酮含量变化趋势。结果表明:1)NtC4H2蛋白属于细胞色素P450超家族成员,有1个跨膜区,为不稳定亲水蛋白,二级结构中α螺旋和无规则卷曲占比较高;2)重组NtC4H2蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于表达细菌中;3)Nt C4H2基因在烟草不同组织的表达水平为下部叶<茎<中部叶<根<上部叶,NtC4H2蛋白活性大小与基因表达量变化趋势相同,表明试验植株在不同生命阶段中的木质化进程会直接影响该基因在各个组织中的表达丰度;4)不同采样时间内上部叶中Nt C4H2基因表达量有明显波动,48 h表达量达峰值,确定了该基因表达模式与叶中黄酮的积累呈正相关。

GRα-GST融合表达载体的构建及重组蛋白的表达

[目的]构建GRα-GST融合表达载体并获得重组蛋白,以期为筛选类糖皮质激素样中药提供工具。[方法]运用RT-PCR扩增得到包含CDS的GRα基因序列后,经T-A克隆插入PMD-18载体。以此重组载体为模板扩增含有BamH I与Xho I酶切位点的GRαORF,插入pGEX-4T-1载体后形成了重组载体,并使其在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达融合蛋白,再用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达。[结果]成功的将GRα-全基因构建入原核表达载体pGEX-4T-1中。测序结果表明载体构建成功,无插入和移码突变。经IPTG诱导后获得与预测大小(112kDa)完全一致的目的蛋白即GRα-GST融合蛋白。[结论]成功获得了含重组载体的大肠杆菌,并在IPTG诱导下较好的表达,得到了GRα-GST融合蛋白。

EB病毒潜伏膜蛋白2A_(1-119)重组质粒的表达及鉴定

目的:构建含EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)潜伏膜蛋白(LMP)2A N端1-119基因的重组质粒,探讨其在原核表达系统中的表达情况。方法:采用RT-PCR方法从B95-8细胞中获得LMP2A1-119外显子基因片段,并克隆到pGEX-4T-1原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导表达融合蛋白,通过Ni-NTA离子交换柱层析纯化,进一步采用SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果:pGEX/LMP2A1-119重组质粒构建成功,并在大肠杆菌中得到表达。SDS-PAGE结果表明表达产物相对分子质量约为50 kD,West-ern blot结果证实其为目的蛋白。结论:EBV LMP2A1-119蛋白可在pGEX-4T-1原核表达系统中表达,为进一步研究其免疫学特性打下了基础。

转移相关基因ABCE1编码蛋白的表达及鉴定

目的构建谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签的ATP结合盒转运子E1(ABCE1)基因的原核表达载体pGEX-4T-1-ABCE1,通过转化技术,诱导GST-ABCE1重组蛋白表达。方法通过基因克隆技术构建融合ABCE1基因的原核表达载体,经酶切和测序等方法进行检测。通过转化技术,在E.coli BL21(DE3)中诱导GST-ABCE1重组融合蛋白表达。经酶切,Western blot和质谱测序等方法对该重组蛋白进行鉴定。结果 ABCE1基因片段成功插入pGEX-4T-1原核表达载体中,双酶切和测序后,经Gen Bank blast比对验证,证实ABCE1基因插入载体部位正确,碱基序列正确。凝血酶酶切检测重组蛋白GST-ABCE1得到72 000大小的特异条带,该条带可以被ABCE1抗体识别,质谱检测得到ABCE1蛋白的特异性序列,该序列评分138分(P<0.05)。结论 pGEX-4T-1-ABCE1原核表达载体质粒构建成功,并成功诱导GSTABCE1重组蛋白表达,为继续研究ABCE1在肺癌中的作用机制奠定基础。

原核表达载体GST-RUNX3的构建及其在大肠杆菌表达

目的构建GST/RUNX3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法利用Kpn1和Xho1位点酶切pcDNA3.1-RUNX3质粒,将获得的1300bpRUNX3编码序列插入到pGEX-4T-2中,构建pGEX-4T-2-RUNX3质粒,并转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入BL21中,经IPTG诱导表达后SDS-PAGE电泳鉴定。结果酶切pGEX-4T-2-RUNX3质粒获得1300bpRUNX3片段,经测序后获得的DNA序列与GenBank进行同源性比对,证实pGEX-4T-2-RUNX3构建成功。在E.coli BL21用IPTG进行诱导表达后,SDS-PAGE电泳方法证实了GST-RUNX3融合蛋白表达。结论成功构建了RUNX3原核表达载体,其融合蛋白在大肠埃希菌表达,为进一步纯化RUNX3蛋白和研究RUNX3的生物学功能奠定了基础。

肺癌转移相关基因ABCE1编码蛋白与β-肌动蛋白的相互作用结构域研究

目的明确肺癌转移相关基因ABCE1编码蛋白与β-肌动蛋白的相互作用结构域。方法通过转化技术,在E.coli BL21(DE3)中诱导表达前期研究获得的表达载体pGEX-4T-1-ABCE1-55,获得GST-ABCE1-55重组融合蛋白表达,应用GST pull-down的方法验证p GEX-4T-1-ABCE1-55与β-肌动蛋白有无相互作用。结果 GST-ABCE1-55是带有GST标签的含有357个氨基酸的重组蛋白,大小约66×10~3,在GST pull-down实验中,GST-ABCE1-55并不能与β-肌动蛋白特异结合。结论肺癌转移相关基因ABCE1编码蛋白与β-肌动蛋白的相互作用结构域应位于ABCE1蛋白第358位至第600位编码氨基酸中。

人可溶型破骨细胞分化因子的克隆原核表达及活性分析

目的克隆人可溶型破骨细胞分化因子（sODF）基因，构建融合表达载体，在大肠杆菌中表达，并制备抗体。方法采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）法得到人可溶型破骨细胞分化因子（ODF）编码区cDNA，克隆入原核表达载体pGEX-4T-3，转化大肠杆菌感受态细胞JM109，0．1mmol／L β—D一半乳糖苷（IPTG）诱导后收集菌体蛋白，行十二烷基硫酸钠-多丙烯酰胺冻胶电泳（SDS—PAGE）。纯化蛋白，体外诱导破骨细胞分化。结果获得人sODF基因cDNA，构建原核表达载体pGEX—ODF，转化菌株可表达人GST—ODF蛋白，蛋白相对分子质量约为43000，Western分析证实为GST—sODF融合蛋白。纯化后的表达产物体外培养人外周血淋巴细胞有破骨细胞形成，象牙片上有骨吸收陷窝形成。结论成功获得人sODF基因cDNA，并在大肠杆菌中表达了人GST-ODF融合蛋白。成功表达的人sODF蛋白有诱导破骨细胞分化的活性。为该蛋白的进一步应用研究提供了依据。