利用iCaspase9特异性诱导鸡原始生殖细胞消除的研究

【目的】制备在生殖细胞特异表达iCaspase9的鸡原始生殖细胞系(PGCs),提升外源性PGCs的生殖传递效率,为生产诱导不育的雄性或雌性受体鸡胚打下基础。【方法】利用piggyBac转座子将iCaspase9片段整合到鸡基因组中,构建稳定转染iCaspase9片段的CAG-iCaspase9-mCherry DF-1细胞系,通过荧光微显镜观察鉴定其在iCaspase9系统诱导底物B/B二聚化配体作用下的细胞消除效果;再利用CRISPR/Cas9技术将iCaspase9片段定点插入DAZL基因第11外显子之后构建Dazl-iCaspase9-EGFP PGCs,经iCaspase9片段插入鉴定和PGCs生殖特性鉴定后,通过荧光微显镜观察鉴定其在B/B二聚化配体诱导下的消除效果。【结果】成功建立的CAG-iCaspase9-mCherry DF-1细胞系与野生型DF-1细胞(WT DF-1)的生长增殖无显著差异(P>0.05,下同);CCK-8法测定发现,0.25~5.00 nmol/L B/B二聚化配体对WT DF-1细胞生长数量无显著影响,但CAG-iCaspase9-mCherry DF-1细胞在添加B/B二聚化配体后,细胞数量较空白对照组极显著降低(P<0.01,下同),且失去正常的细胞形态,逐渐变圆甚至凋亡。成功建立的DAZL-iCaspase9-EGFP PGCs仍特异性高表达Cvh、Nanog、PouV、DAZL、Cdh和Ddx4等生殖细胞相关基因,在蛋白水平上也能鉴定出DAZL、SSEA1和CVH等蛋白,说明插入iCaspse9片段后并没有改变生PGCs的殖细胞特异性;在0.25 nmol/L B/B二聚化配体诱导作用下,DAZL-iCaspae9-EGFP PGCs数量显著减少,几乎全部消除,说明iCaspase9系统可诱导细胞凋亡而有效消除内源性PGCs。【结论】利用i Caspase9系统构建获得的DAZL-iCaspase9-EGFP PGCs在不改变其生殖细胞特性的同时,可在B/B二聚化配体诱导下有效消除内源性PGCs,为建立高效鸡种质资源恢复和基因编辑鸡制备等研究提供无内源性PGCs的受体鸡胚。

鸡胚胎原始生殖细胞的培养和传代

本文旨在探索鸡胚胎原始生殖细胞(Primordialgermcells,PGCs)培养、传代以及各种因素对PGCs培养的影响。实验结果表明,在添加10%的胎牛血清、2%的鸡血清、2mmol/LL谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5.5×10-5mol/Lβ巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、以及5ng/ml人干细胞生长因子(Humanstemcellfactor,hSCF)、10U/ml鼠白血病抑制因子(Mouseleukemiainhibitoryfactor,mLIF)、10ng/ml碱性成纤维生长因子(Fibroblastgrowthfactorbasic,bFGF)、0.04ng/ml人白细胞介素11(Humaninterleukin11,hIL11),10ng/ml胰岛素样生长因子(Humaninsulinlikegrowthfactor,hIGF)的高糖DMEM培养体系中,以多次离散法进行传代获得5-6代鸡胚胎PGCs,有效地维持了PGCs的未分化状态和正常二倍体核型,同时能够定向地诱导分化为神经细胞。

鸡胚胎原始生殖细胞的体外培养

旨在对影响鸡胚胎原始生殖细胞(PGC s)体外培养、传代过程的各种影响因素进行探讨。将分离到的19期鸡胚胎生殖腺的PGC s在以鸡胚成纤维细胞(CEF)为饲养层,添加细胞因子的培养体系中进行培养、传代。经冷冻保存的PGC s在添加细胞因子的培养体系中能增殖,并具有分化能力。从细胞形态、集落形态、增殖生长能力、核型检测、碱性磷酸酶测定等方面对培养过程中的鸡胚胎PGC s进行检测。结果表明,采用传至3代的CEF为饲养层,多次离散法进行传代所获得的5代鸡胚胎PGC s不但能有效维持PGC s的未分化状态和正常二倍体核型,也具有其作为多能性胚胎干细胞的一系列特征。

睾丸生殖细胞肿瘤中CD117的表达及其对精原细胞瘤的鉴别意义

目的:探讨CD117在睾丸生殖细胞肿瘤中的表达及其在鉴别睾丸精原细胞瘤和非精原细胞瘤中的价值和生物学意义。方法:采用CD117单克隆抗体对74例睾丸生殖细胞肿瘤和20例正常睾丸组织进行免疫组化染色,测定不同组织中CD117表达的阳性率、染色密度和染色强度,采用免疫反应积分(IRS)对结果进行分析比较。结果:74例睾丸生殖细胞肿瘤中,45例(60.8%)CD117表达阳性,IRS为(3.89±3.41)分。32例精原细胞瘤中,CD117阳性表达31例,阳性率为96.9%,IRS(6.82±2.76)分,表达部位以细胞膜为主;11例混合性精原细胞瘤中,CD117阳性表达10例,阳性率为90.9%,均为在精原细胞瘤成分中呈弱阳性表达,IRS为(1.25±0.42)分;31例非精原细胞瘤中CD117表达阳性者仅4例,阳性率为12.9%,并且均为胞质内弱阳性染色,IRS仅为(0.60±0.16)分。不同组织来源的睾丸生殖细胞肿瘤两两之间CD117表达差异均有统计学意义(P<0.05)。20例正常睾丸组织CD117均为阳性表达,IRS为(7.30±1.89)分。结论:CD117在睾丸精原细胞瘤细胞膜上有较为特异的表达,其在睾丸生殖细胞肿瘤中的表达对于鉴别精原细胞瘤和非精原细胞瘤有重要价值。

小鼠原始生殖细胞迁移过程中H2A.Z的表达

小鼠原始生殖细胞(PGCs)迁移、增殖、性别分化都受着基因组和DNA表观遗传修饰的调控,H2A.Z与转录激活有关,可能与表观遗传修饰存在联系,通过PGCs单细胞及组织石蜡切片的免疫荧光方法进行研究。结果表明,PGCs在迁移过程中,8.5 dpc时PGCs中不存在H2A.Z;迁移至生殖嵴时H2A.Z主要集中于细胞核,11.5dpc整个PGCs细胞核和细胞质都存在;13.5 dpc雌性的卵母细胞中H2A.Z主要集中于细胞质,而精原细胞中H2A.Z偏向集中于细胞核。综合基因组和DNA表观遗传修饰分析,H2A.Z的表达与其有密不可分的联系。

原发纵隔恶性生殖细胞瘤32例临床分析

目的:探讨纵隔恶性生殖细胞瘤(malignant germ cell tumors,MGCT)的临床特点、治疗和预后。方法:32例纵隔MGCT患者,精原细胞瘤18例,非精原细胞瘤14例。所有患者均采用手术和(或)放疗和(或)化疗等多学科综合治疗的方法。结果:非精原细胞瘤患者中位生存期(OS)32.4个月,中位无进展生存期(PFS)18个月,5年无复发生存率和总生存率均为28.6%。精原细胞瘤患者5年无复发生存率和总生存率分别为83.3%和85.6%,中位OS和PFS均未到达。精原细胞瘤患者OS和PFS均明显好于非精原细胞瘤患者,P值分别为0.001 4和0.000 7。结论:纵隔精原细胞瘤采用多学科综合治疗方法能取得较好的治疗效果,本研究的结果与文献报道相符。纵隔非精原细胞瘤的治疗效果有待进一步提高。非精原细胞瘤是影响纵隔恶性生殖细胞瘤预后的重要因素。

不同时期鸡胚原始生殖细胞的分离及存活时间的研究

采用Ficoll密度梯度离心,提取第14期(孵化53h)血液、第19期(孵化72h)和第28期(孵化132h)性腺中的PGCs,以比较这3个时期的PGCs在相同的体外培养条件下存活时间的差别。培养基为TCM 199,添加10%的小牛血清,不添加其他的细胞因子,培养后采用台盼蓝染色,以比较其在这种培养液中存活时间的差别。结果发现,第14期提取的PGCs存活时间最短,第19期的最长,第28期的介于两者之间。

睾丸混合性非精原细胞性生殖细胞癌1例并文献复习

目的:睾丸混合性非精原细胞性生殖细胞癌的文献报道极少,本文旨在探讨睾丸混合性非精原细胞性生殖细胞癌的临床症状、病理特点及诊疗方法。方法:分析1例睾丸混合性非精原细胞性生殖细胞癌的临床资料,并运用组织学、细胞化学和免疫组化技术对该例睾丸混合性非精原细胞性生殖细胞癌进行光镜观察和免疫标记并结合文献就该类肿瘤的临床特征进行探讨。结果:患者以睾丸无痛性肿大3年就诊,病理组织学表现为肿瘤排列结构多样,有乳头状结构、裂隙或腺样结构,细胞大,呈多角形或柱状,核不规则呈泡状,一个或多个核仁,核膜清楚,胞质嗜碱或嗜酸,间质少量淋巴细胞浸润。免疫组化显示:白细胞分化抗原(CD117)(-)、细胞角蛋白(CK8-18)(++)、CD30(++)、CK(+++)、波形纤维蛋白(Vimentin)(-)、胎盘型碱性磷酸酶(PLAP)(±)、抑癌基因产物(P53)(+)、甲胎蛋白(AFP)(+)和上皮膜抗原(EMA)(++)。病理诊断为睾丸畸胎胚胎癌,行手术根治术,按混合性非精原细胞性生殖细胞癌行术后辅助化疗。随访时间l年,健康生存。结论:睾丸混合性非精原细胞性生殖细胞癌是一种罕见的恶性肿瘤,多数临床症状不明显。诊断主要依靠体格检查、B超、CT、血清肿瘤标记物测定等,确诊需要病理学检查,手术切除是其首选的治疗方法。

小鼠原始生殖细胞迁移过程中macroH2A的表达

通过单细胞及组织石蜡切片的免疫荧光方法,探讨了小鼠原始生殖细胞(PGCs)性别分化与macroH2A的关系。结果表明:PGCs在迁移过程中,macroH2A在细胞核中的表达越来越弱,而在细胞质中的表达越来越强;到达生殖嵴性别分化结束后,雄性PGCs中macroH2A在细胞核和细胞质中基本不表达,而在雌性PGCs细胞质中发现mac-roH2A大量表达。据此推断,macroH2A可能与后期的DNA印记快速擦除及性别分化后细胞分裂相关。

坝上长尾鸡原始生殖细胞的分离、培养与鉴定

为了研究坝上长尾鸡的原始生殖细胞（primordial germcell，PGCs），试验分别从孵化至13-15期的坝上长尾鸡鸡胚血液和5．5d的鸡胚生殖嵴中分离得到PGCs，接种于24孔培养板，以鸡胚成纤维细胞（CEF）为饲养层，添加细胞因子的培养体系，在温度37℃、95％空气和5％CO2培养箱中进行体外培养和传代，借助组织化学及免疫组织化学方法进行染色，并采用PAS（高碘酸希夫氏染色）、AKP（碱性磷酸酶染色）以及SSEA-1等方法进行鉴定。结果表明：PGCs集落有典型的鸟巢状结构，且PAS、AKP以及SSEA-1染色呈阳性。

睾丸非精原细胞性生殖细胞肿瘤68例

目的:总结原发性睾丸非精原细胞性生殖细胞肿瘤(NSGCT)的诊断与治疗体会。方法:回顾性分析收治的68例NSGCT临床资料。胚胎癌35例,畸胎瘤11例,卵黄囊瘤3例,绒毛膜上皮癌6例,混合性生殖细胞瘤13例。睾丸无痛性肿大为其主要临床表现。在根治性睾丸切除基础上采用腹膜后淋巴结清扫术(RPLND)及化疗等综合治疗措施。结果:全组患者中随访63例,失访5例。睾丸肿瘤的B超诊断优于CT,腹膜后淋巴结的CT诊断优于B超。3、5年生存率与国内外报道相似。结论:NSGCT在根治性睾丸切除基础上采用RPLND及化疗等综合治疗措施,疗效满意。B超和CT为其诊断和临床分期的主要手段。肿瘤标记物对治疗以及预后判断有一定参考价值。

鱼类原始生殖细胞与鱼类性别分化的关系

在鱼类的性别分化中,原始生殖细胞在雌雄二性中的增殖方式不同,而且在部分鱼类中原始生殖细胞的缺失能导致其发育为单一雄性表型。在此过程中,生殖细胞的特有基因vasa的剪接变体的二态性分布与鱼类原始生殖细胞的分化关系密切。

生殖细胞核因子在精原干细胞体外培养分化中的表达

目的将分离纯化的小鼠精原干细胞(SSCs)体外培养并诱导分化,检测生殖细胞核因子(GCNF)在小鼠SSCs诱导分化前后的表达。方法用干细胞因子(SCF)诱导小鼠SSCs向精母细胞分化,通过间接免疫荧光染色和RT-PCR,检测GCNF在小鼠SSCs诱导分化前后的表达。结果小鼠SSCs向精母细胞诱导分化前后,在倒置相差显微镜下进行形态学观察,细胞形态未发生明显变化,仍然呈圆形或椭圆形,核较大;间接免疫荧光及RT-PCR结果均显示,原代培养的小鼠SSCs呈现GCNF阴性,但是向精母细胞诱导分化2d后,GCNF开始表达。结论 GCNF在体外培养小鼠SSCs向精母细胞分化的早期有表达,提示GCNF可能参与了SSCs的早期分化。

原发性睾丸非精原细胞性生殖细胞肿瘤26例分析

目的 :总结原发性睾丸非精原细胞性生殖细胞肿瘤 (NSGCT)的诊断与治疗体会。方法 :回顾性分析收治的 2 6例NSGCT的临床资料。 2 6例中 ,胚胎癌 7例 (2 6 .9% ) ,畸胎瘤 5例 (19.2 % ) ,卵黄囊瘤 4例(15 .4 % ) ,绒毛膜上皮癌 1例 (3.9% ) ,混合性生殖细胞瘤 (MGCT) 9例 (34.6 % )。睾丸无痛性肿大为其主要临床表现。Ⅰ期 16例 ,Ⅱ期 8例 ,Ⅲ期 2例。在根治性睾丸切除基础上采用腹膜后淋巴结清扫术及化疗等综合治疗措施。结果 :2 2例获随访 ,随访时间 6个月～ 6 .5年 ,术后复发 2例 ,2例死于全身广泛转移 ,其余患者均健康生存。结论 :NSGCT中以MGCT及胚胎癌最为常见 ,B超、CT或MRI为其诊断和临床分期的主要手段。

Oct-4及生殖细胞核因子在精原干细胞体外分化前后的表达

目的：检测Oct-4和生殖细胞核因子（GCNF）在小鼠精原干细胞（SSCs）诱导分化前后的表达。方法：体外分离培养小鼠SSCs，用干细胞因子（SCF）诱导其向精母细胞方向分化，通过间接免疫荧光显色和RT-PCR，检测Oct-4和GCNF在小鼠SSCs诱导分化前后的表达。结果：Oct-4在小鼠SaCs诱导前有表达，诱导2d后表达下降；而GCNF在小鼠SaCs诱导前呈阴性表达，向精母细胞诱导2d后呈阳性表达。结论：GCNF可能通过抑制Oct-4的表达促使SSCs分化。

鸡胚原始生殖细胞的冷冻保存和体外培养

采用Ficoll密度梯度离心,提取第19期(孵化72h)鸡受精蛋性腺中的原始生殖细胞(primordialgermcells,PGCs),用不同的冷冻保护液对PGCs采用提纯后直接冷冻保存和在培养体系中培养24h后再进行冷冻保存,7d后复苏,用台盼蓝染色检测其存活率,并用PAS染色对冷冻后的PGCs进行特异性鉴定。复苏后的PGCs在培养体系中培养5d后,更换为培养体系继续培养,进行体外分化试验。结果如下分离后直接进行冷冻保存的PGCs复苏后存活率最高为(85.93±1.24)%;复苏后的PGCs在培养体系中培养48h后进行了PAS染色鉴定,结果PGCs呈PAS阳性(细胞核不着色,细胞质呈红色),表明PGCs的染色特性没有因冷冻保存和体外培养而发生改变;复苏后的PGCs在培养体系中培养可形成细胞克隆,当把PGCs更换到培养体系培养5d后,PGCs克隆有的仍保持克隆状态,但体积缩小,克隆中细胞排列紧密,颜色较深,有的克隆由鸟巢状变为不规则形,且在克隆周围形成类神经细胞样细胞。而经体外培养后再进行冷冻保存的PGCs,复苏后存活率最高为(42.26±1.36)%。

原发性纵隔恶性生殖细胞肿瘤临床研究

目的探讨原发纵隔恶性生殖细胞肿瘤的诊治与预后。方法本院共收治原发纵隔恶性生殖细胞肿瘤18例,其中男性15例,女性3例,中位年龄23岁(15～51岁);精原细胞瘤6例,非精原细胞瘤12例。结果 13例行姑息性手术切除,5例接受了活检。多数病人接受了术后以顺铂为主的联合化疗,15例同时接受术后放疗。6例精原细胞瘤中4例生存,1例死亡。12例非精原细胞瘤中11例死亡,中位生存时间为13个月(4～45个月),仅1例治疗后45个月无瘤生存。结论原发纵隔恶性生殖细胞瘤为一种高度恶性肿瘤,精原细胞瘤对术后以顺铂为主的联合化疗和放疗疗效好,而非精原细胞瘤恶性度高,治疗疗效和预后差。

禽原始生殖细胞的研究进展

原始生殖细胞(PGCs)是指能发育为精子或卵子的祖先细胞。早期胚胎的PGCs适用于各种各样的研究,包括用于发育生物学研究、药理研究、移植治疗、性腺嵌合体制备、转基因动物生产等。禽肉与禽蛋产品是人类蛋白质摄入的重要来源,将禽PGCs用于禽类繁殖和生命科学研究等领域有着广阔的应用前景。文章阐述了禽PGCs的起源与迁移、体外培养方法及应用。